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1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

貨號(hào): BC4420

規(guī)格: 50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、試劑三：臨用前加入2.5 mL蒸餾水溶解,，現(xiàn)配現(xiàn)用，-20℃分裝保存,，-20℃保存一周,；

2、試劑四：臨用前每瓶加入3 mL蒸餾水溶解,，現(xiàn)配現(xiàn)用,，-20℃分裝保存，-20℃保存一周,。

產(chǎn)品說(shuō)明：

在干旱,、鹽漬化、重金屬,、紫外線(xiàn)等不同的脅迫條件下,，均會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)脯*酸的積累，對(duì)植物起到保護(hù)作用,。高等植物中,，脯*酸的合成有兩條途徑，分別以谷*酸和鳥(niǎo)*酸為前體,。谷*酸途徑主要負(fù)責(zé)脅迫條件下脯*酸的積累,，而鳥(niǎo)*酸途徑主要在氮充足條件下起作用，與脅迫情況下脯*酸的積累沒(méi)有關(guān)系,。

1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯*酸的谷*酸合成途徑中的關(guān)鍵酶,，P5CS是一個(gè)雙功能酶，在NADPH和ATP作用下,，可催化谷*酸磷酸化及谷*酸 γ-半醛還原,，通過(guò)測(cè)定NADPH在340 nm處吸光度的變化，可計(jì)算出P5CS的活性高低,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì),、低溫離心機(jī),、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1 mL石英比色皿,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水,、EP管,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織樣本：按質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）1︰5~10比例（建議稱(chēng)取0.1 g樣本,，加入1.0 mL提取液一）加入提取液一,，再加入10 μL提取液二，冰浴勻漿后于4℃,，8000 rpm,，離心15 min，棄沉淀,，取上清液置于冰上待測(cè),。

二、測(cè)定步驟

1,、 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340 nm，蒸餾水調(diào)零,。  

2,、 將試劑三、試劑四置于冰上待測(cè),。

3,、 操作表：（在1 mL石英比色皿中操作）

注意：空白管只需測(cè)定1-2次,。

三、P5CS酶活計(jì)算

1,、按樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol NADPH為一個(gè)酶活單位,。

P5CS酶活（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T =321.54×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗1 nmol NADPH為一個(gè)酶活單位,。

P5CS酶活（U/g 質(zhì)量）= ΔA÷ε÷d×V反總×10⁹÷(W×V樣÷V樣總)÷T =324.76×ΔA÷W

ε：NADPH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1 cm,；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.1 mL,；V樣總：加入提取液體積,，1.01 mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min,；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù),，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1,、當(dāng)A1測(cè)定高于1.2或者ΔA大于0.5時(shí),，建議將樣本稀釋后檢測(cè)，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

2,、盡量使用新鮮樣本進(jìn)行檢測(cè)，操作時(shí)請(qǐng)置于冰上操作,。

3,、ΔA空白管的數(shù)值一般不超過(guò)0.05。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1,、取0.1g三葉草進(jìn)行樣本處理,，樣本稀釋2倍，按照測(cè)定步驟操作,，計(jì)算得ΔA測(cè)定管= A1測(cè)定-A2測(cè)定=0.923-0.895=0.028,，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.667-0.659=0.008，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.02,，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

P5CS酶活（U/g 質(zhì)量）=324.76×ΔA÷W×稀釋倍數(shù)=129.9 U/g 質(zhì)量,。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0290/BC0295 脯*酸（PRO）含量檢測(cè)試劑盒

BC1580/BC1585 谷*酸（Glu）含量檢測(cè)試劑盒

BC4400/BC4405 鳥(niǎo)*酸轉(zhuǎn)氨酶（δ-OAT）活性檢測(cè)試劑盒

BC0070/BC0075 谷*酸合成酶（GOGAT）活性檢測(cè)試劑盒

BC1550/BC1555 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性檢測(cè)試劑盒

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