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木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作,。

貨號：BC1610

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

產(chǎn)品說明：

木質(zhì)素過氧化物酶（EC1.11.1.14）（Lip）是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶,，是木質(zhì)素的生物降解過程中的主要木質(zhì)素降解酶類。Lip在飼料資源開發(fā)以及廢水,、廢物處理領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景,。藜蘆醇可以被Lip催化發(fā)生氧化反應(yīng)，其產(chǎn)物藜蘆醛在310nm處有最大吸收峰,，以藜蘆醇為反應(yīng)底物,，通過測定310nm處藜蘆醛的吸光值，可以判定Lip的酶活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計,、低溫離心機(jī),、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器,、超聲波細(xì)胞破碎儀,、研缽/勻漿器、1mL石英比色皿、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、組織：按照樣本質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿,；10000g 4℃離心10min,，取上清置冰上待測。

2,、細(xì)菌或細(xì)胞樣本：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一）加入試劑一,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率300W，超聲 3s,，間隔 7s,，總時間3min），10000g 4℃離心10min,，取上清置冰上待測,。

3、培養(yǎng)液或其他液體：直接檢測,。若溶液渾濁則離心后取上清進(jìn)行測定。

二,、測定步驟

1,、可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至310nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、測定前根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量取出部分試劑一,、試劑二,、試劑三置于37℃預(yù)熱10min以上。若一次性測定樣本過多,，可根據(jù)使用量將試劑一,、二、三按6:2:1比例配成工作液后進(jìn)行預(yù)熱,，測定時按照100μL樣本+900μL工作液加入1mL石英比色皿進(jìn)行測定,。

3、加樣表（在 1mL石英比色皿中依次加入下列試劑)：

    將上述試劑分別加入1mL石英比色皿后迅速吹打混勻，從加完最后一個試劑開始計時,，記錄第15s的吸光值A1,，將混合液置于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5min，取出測定5min15s時的吸光值A2,，計算ΔA=A2-A1,，注意保證測定時間的準(zhǔn)確性。

三,、Lip活力的計算

1.按樣本蛋白質(zhì)濃度計算

酶活定義：37℃,，pH4.5條件下，每mg組織蛋白每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位,。

Lip活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T=215.05×ΔA÷Cpr

2.按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：37℃,，pH4.5條件下，每g組織每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位,。

Lip活性（U/g 質(zhì)量）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=215.05×ΔA÷W

3.按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃,，pH4.5條件下，每10⁴細(xì)菌/細(xì)胞每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需的酶量為一個酶活單位,。

Lip活性（U/10⁴ cell）= ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷(V樣÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量)÷T=215.05×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4,、 按照樣本體積計算

酶活定義：37℃，pH4.5條件下,，每mL血清或液體樣本每分鐘氧化1nmol藜蘆醇所需酶量為一個酶活單位,。

Lip活性（U/mL）=ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷V樣÷T=215.05×ΔA

ε：藜蘆醛摩爾消光系數(shù)：9300L/mol/cm；d:比色皿光徑,，1cm,；V反總：反應(yīng)總體積，0.001L,；V樣：加入樣本體積,，0.1mL，V樣總：提取液體積,，1mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；T：反應(yīng)時間,，5 min,；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

取0.09g杏鮑菇加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿,。10000g 4℃離心10min,，取上清置冰上，之后按照測定步驟操作,，測得計算A1=0.228,，A2=0.55，ΔA=A2-A1=0.322,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

Lip活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA×V反總÷(?×d)×10⁹÷V樣÷T=672.95U/g 質(zhì)量,。

參考文獻(xiàn)：

[1] Konadu K T, Harrison S, Osseo-Asare K. et al. Transformation of the carbonaceous matter in double refractory gold ore by crude lignin peroxidase released from the white-rot fungus[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2019, 143(1996):104735.

[2] Ahmed A A Q, Mckay T J M. Potential of Bacillus sp. LG7 as a Promising Source of Ligninolytic Enzymes for Industrial and Biotechnological Applications[J]. Proceedings of the National Academy of ences India, 2017.

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