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ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。

貨號(hào)：BC4240

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致,，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 提取液二：為易揮發(fā)試劑,，用完后盡快密封,，-20℃保存；

2,、 試劑二：臨用前加入1.3 mL試劑一溶解,；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融,；

3,、 試劑三：臨用前加入6 mL試劑一溶解；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周,，避免反復(fù)凍融,；

4、 試劑四：臨用前加入1 mL試劑一溶解,；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周,，避免反復(fù)凍融；

5,、 試劑五：臨用前加入0.5mL蒸餾水充分溶解,；用不完的試劑可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融,；

6,、 試劑五工作液：根據(jù)樣本量按照試劑五：蒸餾水=0.025mL：0.8mL（共0.825mL，約16T）的比例進(jìn)行配制,，現(xiàn)用現(xiàn)配,，當(dāng)天用完；

7、 提取液的配制：按提取液一︰提取液二=990︰10（V︰V）的比例配制,，根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用,，禁止將提取液二一次性全部加入提取液一混勻分裝待用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

ATP-檸檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase,，ACL）是催化檸檬酸生成乙酰*酶A的關(guān)鍵胞質(zhì)酶,，其催化產(chǎn)生的乙酰*酶A是合成脂肪酸與膽*醇等脂類(lèi)物質(zhì)的主要原料，并可參與相關(guān)重要蛋白的修飾作用,，是體內(nèi)能源物質(zhì)代謝的樞紐性物質(zhì)。

在ATP和*酶A存在的情況下,，ACL能將檸檬酸催化裂解為乙酰*酶A,、草酰乙酸、ADP和磷酸鹽,，蘋(píng)果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋(píng)果酸和NAD⁺,，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè),。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、天平,、臺(tái)式低溫離心機(jī),、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀,、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、冰,、蒸餾水,。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、組織：按照質(zhì)量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿,。于4℃,，8000g離心10min，取上清,，置于冰上待測(cè),。

2、細(xì)胞或細(xì)菌：按照細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）︰提取液體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌（功率300W,，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）,，于4℃,，8000g離心10min，取上清,，置于冰上待測(cè),。

3、血清（漿）或其他液體：直接檢測(cè),。

二,、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 將試劑一置于37℃水浴10min,。

3、 操作表 (在1mL石英比色皿中依次加入下列試劑) ：

注意：如果樣本量大,，可按試劑一︰試劑二︰試劑三︰試劑四︰試劑五工作液=760︰20︰100︰20︰50的比例配制成工作液使用，工作液應(yīng)根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用,。

三,、ACL活性計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位

ACL活性（U/mg prot）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(V樣×Cpr) ÷T=1607.7×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1607.7×ΔA÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

單位定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

ACL活性（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）] ÷(N×V樣÷V樣總) ÷T=1607.7×ΔA÷N

4. 按液體體積計(jì)算

單位定義：每mL液體每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

ACL（U/mL）=[ΔA×V反總×10⁹÷（ε×d）]÷V 樣÷T=1607.7×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，1×10^-3 L,；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù),，1mol=10⁹nmol；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×10³ L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V樣：加入樣本體積,，0.05mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：蛋白濃度,，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定,；W：樣本質(zhì)量,，g；N：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量,，以萬(wàn)計(jì),；T：反應(yīng)時(shí)間，2min,。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g黑麥草,，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，于4℃,，8000g離心10min，取上清,，按照測(cè)定步驟操作,，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管= A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.549-1.512=0.037，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.411-0.41=0.001,，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.037-0.001=0.036,，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=1607.7×ΔA÷W=578.772 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1g肝臟組織,，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,，于4℃，8000g離心10min,，取上清,，按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定管= A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.165-0.985=0.179,，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.411-0.41=0.001,，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.179-0.001=0.178，按樣本質(zhì)量計(jì)算得：

ACL活性（U/g 質(zhì)量）=1607.7×ΔA÷W=2861.706 U/g 質(zhì)量,。

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC0750/BC0755 乙醛脫氫酶（ALDH）活性檢測(cè)試劑盒

BC0410/BC0415 乙酰*酶A羧化酶（ACC）活性檢測(cè)試劑盒

BC1980/BC1985 總膽*醇（TC）含量檢測(cè)試劑盒

ATP-檸檬酸裂解酶活性檢測(cè)試劑盒 脂肪酸 ATP-檸檬酸裂解酶活性檢測(cè)試劑盒 脂肪酸