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肌酸激酶（CK）活性檢測試劑盒說明書 

微量法

貨號：BC1145

規(guī)格：100T/96S 

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1,、 試劑一：臨用前加5 mL蒸餾水溶解；用不完的分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

2、 試劑二：臨用前加入0.5 mL蒸餾水溶解,；用不完的分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融；

3,、 試劑三：臨用前加入0.5 mL蒸餾水溶解,；用不完的分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,；

4,、 試劑四： 臨用前加入0.65 mL蒸餾水溶解；用不完的分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,；

5、 工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑一,、試劑二,、試劑三、試劑四,、試劑五以70:4:7:10:90的比例混合（體積比）?，F(xiàn)用現(xiàn)配。使用前室溫孵育20min（該步驟不可省略）,。

產(chǎn)品說明： 

肌酸激酶（Creatine Kinase,，CK） (EC 2.7.3.2)也成為肌酸磷酸激酶，主要存在于心臟,、肌肉以及腦等組織中,，能可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷酰基反應(yīng),，是一個與細胞能量運轉(zhuǎn),、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶,。

 CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP,，己糖激酶催化ATP與葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化6-磷酸葡萄糖與NADP⁺生成NADPH，導(dǎo)致340nm光吸收值增加,，以此來表示CK酶活。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。

需自備的儀器和用品：

天平、低溫離心機,、恒溫水浴鍋,、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔UV板,、恒溫水浴鍋,、研缽/勻漿器、蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿,，然后10000g，4℃離心15min,，取上清,，置冰上待測。

2. 血清樣本：直接測定,。

3. 細胞樣本：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液）加入提取液,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒,，間隔7秒,，總時間3min）；然后于4℃,，10000g離心10min,，取上清待測。

二,、測定步驟

1,、 分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm,，用蒸餾水調(diào)零,。

2、 操作表：在微量石英比色皿/96孔板中加入下列試劑

三,、CK 活性計算

1,、按微量石英比色皿計算

(1) 按組織蛋白濃度計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時,，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位,。

CK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr) ÷T=268×ΔA÷Cpr

(2) 按組織樣本質(zhì)量計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時,，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位,。

CK活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W) ÷T=268×ΔA÷W

(3) 按血清體積計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時,，每mL血清每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位,。

CK活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=268×ΔA

(4) 按細胞數(shù)量計算：

酶活定義：37℃，pH7.0時,，每1萬個細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH為一個酶活單位,。

CK活性（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)÷T=268×ΔA÷細胞數(shù)量

ε：NADPH的摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10^-4L,；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.04mL,；V樣總：提取液體積,，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；細胞數(shù)量：以10⁴為單位計算,，萬個；T：反應(yīng)時間,，3min,；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol,。

2,、按96孔UV板計算

將上述公式中的d=1cm改為0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。

注意事項：

1. 血清的CK不穩(wěn)定，采集樣本后盡快測定,，4℃避光保存可穩(wěn)定24h,。

2. 樣本蛋白質(zhì)含量需要另外測定。

3. OD 值大于0.6可用提取液適當(dāng)稀釋樣本,，并在計算公式中相應(yīng)的改變稀釋倍數(shù),。

4. ΔA空白管一般不超過0.01。

實驗實例：

1,、 取0.1g小鼠腦加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后再用提取液稀釋8倍,，之后按照測定步驟操作,，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.4175-0.1314=0.2861，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.1304-0.1256=0.0048,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.2861-0.0048=0.2813,，按組織樣本質(zhì)量計算得：

CK活性（U/g 質(zhì)量）=268×ΔA÷W×8（稀釋倍數(shù)）=268×0.2813÷0.1×8（稀釋倍數(shù)）=6031.072 U/g 質(zhì)量。

2,、 取兔血清直接檢測,，用微量石英比色皿測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.5761-0.4649=0.1112，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.1304-0.1256=0.0048,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.1112-0.0048=0.1064,，按血清體積計算得：CK活性（U/mL）=268×ΔA=268×0.1064=28.5152 U/mL。

相關(guān)發(fā)表文獻：

[1] Defang Li, Ning Lu, Jichun Han,et al. Eriodictyol Attenuates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury through the Activation of JAK2. Frontiers in Immunology. January 2018;(IF3.845)

[2] Xu Y, Meng X, Hou X, et al. A mutant of the Buthus martensii Karsch antitumor-analgesic peptide exhibits reduced  inhibition to hNav1. 4 and hNav1. 5 channels while retaining analgesic activity[J].Journal of Biological Chemistry, 2017,  292(44): 18270-18280

相關(guān)系列產(chǎn)品：

BC2030/ BC2035 異檸檬酸裂解酶（ICL）活性檢測檢測試劑盒

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