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肝脂酶（HL）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動,，請注意并嚴格按照該說明書操作,。
貨號：BC2380
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：
1,、試劑三：臨用前加入30 mL蒸餾水，充分溶解待用,，用不完的 2-8℃保存8周,；
2、試劑四：臨用前取1瓶加入2 mL蒸餾水,，充分溶解,，用不完的試劑可-20℃分裝保存2周,，避免反復凍融；
3,、標準品：臨用前加入6.94 mL丙 酮,，配成10 μmol/mL α-萘酚標準溶液，充分溶解待用,，用不完的-20℃保存4周,。
產(chǎn)品說明：
肝脂酶（hepaticlipase，HL）是一種脂肪分解酶,，在肝實質(zhì)細胞中合成,，存在于肝臟竇周間隙內(nèi)皮細胞表面和竇周間隙腔面的肝細胞微絨毛表面，可水解各種脂蛋白中的甘油三酯（TG）和磷脂（PL）,，使各種脂蛋白顆粒的大小和密度發(fā)生變化,，當血漿中的HL及其活性增高時，可導致血漿中低密度脂蛋白（LDL）水平升高,，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展,。
肝脂酶水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生α-萘酚，可與固藍B鹽形成紫紅色偶氮化合物,，在595 nm有特征吸收峰,，其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與肝脂酶活性成正相關(guān)。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測,。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、天平,、低溫離心機,、水浴鍋、1 mL玻璃比色皿,、可調(diào)式移液槍,、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、EP管,、 丙 酮,、蒸餾水。
操作步驟：
一,、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻）

1、組織：按照質(zhì)量（g）︰試劑一體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取樣本約0.1g,，加入1mL試劑一）,，加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃,，10000 g離心10 min,，取上清待測,。
2、細胞：按照細胞數(shù)量（10⁴個）︰試劑一體積（mL）為500~1000︰1的比例（建議500萬細胞加入1 mL試劑一）加入試劑一,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300W,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3 min）,；然后于4℃，10000g離心10 min,，取上清待測,。
3、血清/血漿：直接檢測,。（若液體有渾濁則離心后進行測定）
二,、測定步驟

1. 分光光度計預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至595 nm,，用蒸餾水調(diào)零,。

2. 將試劑一在30℃預熱20 min以上。

3. 將10 μmol/mL 的標準溶液用試劑一稀釋為1.25,、0.625,、0.3125、0.15625,、0.078 μmol/mL的標準溶液備用,。

4. 標準品稀釋表

實驗中每個標準管需100µL標準溶液。

1. 操作表：(在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑)

三,、HL酶活計算

1. 標準曲線的繪制：

根據(jù)標準管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA標準（y,，ΔA標準）,，建立標準曲線。根據(jù)標準曲線,，將ΔA（y,，ΔA）帶入公式計算樣本濃度（x,，μmol/mL）。

1. HL酶活的計算：

（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1 μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位,。
HL活性（U/mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.1x÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每克組織每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1 μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位,。
HL活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T=0.1x÷W
（3）按照細胞數(shù)量計算
酶活定義：每10⁴個細胞每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1 μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位。
HL活性（U/10⁴ cell）=x×V樣÷（V樣×N÷V樣總）÷T=0.1x÷N
（4）按液體體積計算
酶活定義：每毫升血清/血漿每分鐘水解α-乙酸萘酯產(chǎn)生1μmol的 α-萘酚為一個酶活力單位,。
HL活性（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T=0.1x
V樣：反應體系中加入樣本體積,，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL,，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量,，g,；V樣總：加入試劑一體積，1 mL,；T：反應時間,，10 min；N：細胞數(shù)量,，以萬計,。
注意事項：

1. 若樣本為動物肝臟，建議將樣本用試劑一稀釋25倍以上再進行檢測,，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

2. 若樣本為肥胖型動物血清或血漿，建議將樣本用試劑一稀釋5倍以上再進行檢測,，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

3. 當ΔA大于0.8時，建議將樣本用試劑一稀釋后再進行測定,，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

實驗實例：

1. 取0.1g大鼠肝臟，進行樣本處理,，取上清稀釋48倍后按照操作步驟進行操作,，測得計算ΔA=A測定管-A對照管=0.713-0.001=0.712，帶入標準曲線y = 0.6381x - 0.0005,，計算x=1.1166,，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：HL活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷（W×V樣÷V樣總）÷T×48=53.597 U/g 質(zhì)量。

2. 取火雞血清稀釋12倍后按照操作步驟進行操作,，測得計算ΔA=A測定管-A對照管=0.572-0.003=0.569,，帶入標準曲線y = 0.6381x - 0.0005，計算x=0.892，按照液體體積計算酶活得：HL活性（U/mL）=x×V樣÷V樣÷T×12=1.071 U/mL,。

相關(guān)系列產(chǎn)品：
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