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漆酶活性檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC1630

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1. 工作液的配制：一瓶試劑二用25 mL試劑一溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

漆酶（CE1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶,，屬于銅藍(lán)氧化酶家族，漆酶存在菇,、菌及植物中,，是一種環(huán)保型酶，其催化性質(zhì)在生物檢測中有廣泛的應(yīng)用,。

漆酶分解底物ABTS產(chǎn)生ABTS自由基，在420nm處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物ABTS,，測定ABTS自由基的增加速率,，可計算得漆酶活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機(jī),、1mL玻璃比色皿,、可調(diào)式移液槍、天平,、研缽/勻漿器,、冰和蒸餾水，水浴鍋

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）   

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）,，進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

2,、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液）,，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后4℃，10000g離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3、培養(yǎng)液：直接檢測,。

二,、測定步驟

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至420nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 水浴鍋溫度調(diào)至45℃,。

3、 操作表：在1mL玻璃比色皿中分別加入下列試劑：

三、漆酶活計算

1,、按蛋白濃度計算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位,。

漆酶酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×Cpr）÷T=61.7×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每克樣本每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位,。

漆酶酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×W÷V樣總）÷T=61.7×ΔA÷W

3,、按細(xì)胞數(shù)量計算

酶活定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位。

漆酶酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（V樣×500÷V樣總）÷T=0.123×ΔA

4,、按液體體積計算

酶活定義：每mL液體每分鐘氧化1nmol底物ABTS所需的酶量為一個酶活力單位,。

漆酶酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=61.7×ΔA

ε：ABTS摩爾消光系數(shù)：36000L/mol/cm；d：比色皿光徑,，1cm,；V反總：反應(yīng)總體積，0.001L,；V樣：反應(yīng)中樣本體積,，0.15mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL，蛋白濃度需自行測定,；W,，樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時間,，3min；500：細(xì)胞總數(shù),，500萬,；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol,。

注意事項：

1,、工作液需臨用前配制，并且盡快使用,，4℃保存一周,，若變色則不能使用。

2,、測定之前進(jìn)行預(yù)實驗,，若吸光值較高，請將樣本用提取液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧贉y定,，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù),。

3、空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔,，正常情況下,，OD值變化不超過0.05。

實驗實例：

1. 取0.1g香菇加1mL提取液進(jìn)行樣本處理,，取上清后按照測定步驟操作,，測得計算ΔA測定管=A2測定-A1測定=0.657-0.084=0.573，ΔA空白管=A2空白-A1空白=0.087-0.058=0.029,，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.573-0.029=0.544,，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

漆酶酶活（U/g 質(zhì)量）=61.7×ΔA÷W=61.7×0.544÷0.1=335.648 U/g 質(zhì)量。

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