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NADPH-細(xì)*色素C還原酶（NCR）活性檢測(cè)試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng),，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào)：BC2720

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致,，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員,。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一瓶加入50mL蒸餾水,，充分溶解,；用不完的試劑2-8℃保存可保存4周；

2,、 試劑三：臨用前取一瓶加入1.3mL蒸餾水,，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周,，避免反復(fù)凍融,。

3、 試劑四：臨用前取一支加入275μL蒸餾水,，充分溶解,；用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融,。

產(chǎn)品說明：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝,。NCR作為P450酶系的重要一員,，催化氧化型P450還原再生。

NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)*色素C,，還原型細(xì)*色素C在550nm處有特征吸收峰,；通過測(cè)定550nm吸光度的增加速率，來計(jì)算NCR活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì),、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋,、低溫離心機(jī)、超速離心機(jī),、研缽/勻漿器,、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿,、冰和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、粗酶液提取（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量,，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1,、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一,，冰上充分研磨,，10 000g，4℃離心30min,，取上清液,，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2,、粗制微粒體：4℃,，100 000g，離心60min,，棄上清液,。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,，蓋緊后充分震蕩溶解,，100 000g離心30min，棄上清液,。

4,、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加0.5mL試劑二，蓋緊后充分震蕩溶解,，即粗酶液,，置于冰上待測(cè)。

二,、測(cè)定步驟

1、 可見分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至550nm,，蒸餾水調(diào)零。

2,、 臨用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量取出部分試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min,。

3、空白管：取1mL玻璃比色皿,，依次加入50μL蒸餾水,、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四,，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化,，測(cè)定第10s和第130s吸光值,，分別記為A1、A2,。計(jì)算ΔA空白=A2-A1,。空白管只需做1-2次。

4,、測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿,，依次加入50μL粗酶液、900μL試劑二,、50μL試劑三和10μL試劑四,，迅速混勻后于550nm處測(cè)定2min內(nèi)吸光值變化，測(cè)定第10s和第130s吸光值,，分別記為A3,、A4。計(jì)算ΔA測(cè)定=A4-A3,。

三,、NCR活性計(jì)算

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下,，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)*色素C為1個(gè)酶活單位,。

NCR (U/mg prot)= (ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷（Cpr×V樣）÷T

= 0.529×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃條件下,，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原型細(xì)*色素C為1個(gè)酶活單位,。

NCR (U/g 質(zhì)量)= (ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.265×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W

ε：還原型細(xì)*色素C摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積,，1010μL=0.00101L,；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定,；V樣：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積,，50μL=0.05mL；V樣總：樣本處理中最后加入試劑二體積,，0.5mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；T：反應(yīng)時(shí)間,，2min。

注意事項(xiàng)：

1,、如果測(cè)定吸光值A＞1.2或ΔA＞0.8,，建議稀釋樣本后再測(cè)定,，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2,、如果測(cè)定吸光值較低或接近空白OD值,，建議增加樣本量后再進(jìn)行測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式,。

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