人核基質(zhì)蛋白22（NMP-22）酶聯(lián)免疫分析試劑盒說明書
人核基質(zhì)蛋白22（NMP-22）酶聯(lián)免疫分析試劑盒
基質(zhì)蛋白：本試劑盒用于測(cè)定人血清,，血漿及相關(guān)液體樣本中核基質(zhì)蛋白22（NMP-22）的含量。
基質(zhì)蛋白實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）水平,。用純化的
人核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加
入核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）,，再與 HRP 標(biāo)記的核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）抗體結(jié)合,，形成
抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色,。TMB在HRP 酶的催化下
轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的核基質(zhì)蛋白 22
（NMP-22）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測(cè)定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算
樣品中人核基質(zhì)蛋白 22（NMP-22）含量。
基質(zhì)蛋白樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘,，離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后,，離心
20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次
離心,。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集,。離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/
分）。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS （PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞
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濃度達(dá)到100 萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心 20分
鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量,。加入一定量的PBS ，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用,。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS （PH7.4）,，用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分,。離心 20分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待
檢測(cè),，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP ）活性,。
基質(zhì)蛋白操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔，在*,、第二孔中分別加標(biāo)
準(zhǔn)品100μl,，然后在*、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻,；然后從*孔、第二
孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔,，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，
混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉,，再各取 50μl 分別加到第五,、第六孔
中，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul ,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各
取50μl 分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混
勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)
品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，
濃度分別為 9 U/ml ，6 U/ml ,，3 U/ml ,，1.5 U/ml ， 0.75 U/ml ）,。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測(cè)樣
品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測(cè)樣品 10μl（樣
品終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混
勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育30 分鐘,。
4. 配液：將 30（48T 的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T 的20倍）倍稀釋后備用,。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置 30秒后棄去,，如此
重復(fù)5 次,，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,，空白孔除外,。
7. 溫育：操作同 3,。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 μl,，再加入顯色劑 B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。
11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）,。 測(cè)定應(yīng)在加終止
液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。
基質(zhì)蛋白注意事項(xiàng)：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未
用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。
2．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間好
控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4．請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，好做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD值
大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值）,，請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測(cè)定，計(jì)
算時(shí)請(qǐng)后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
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5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。
6．底物請(qǐng)避光保存,。
7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9．本試劑不同批號(hào)組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準(zhǔn),。
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為0.95 以上。
2. 批內(nèi)與批間應(yīng)分別小于 9%和11%
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
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