邁瑞動物醫(yī)療免疫分析儀

免疫檢測是利用抗原和抗體之間的特異性親和反應(yīng)來檢測和分析免疫蛋白、受體等生物分子的一種高靈敏度,、高選擇性的方法,。免疫學(xué)檢測技術(shù)能夠用于免疫疾病的診斷、療效評價及發(fā)病機制的研究,，如對傳染病,、免疫增殖性疾病、免疫缺損病,、超敏反應(yīng),、自身免疫病、腫瘤標(biāo)志物等的免疫學(xué)檢測,，具有廣泛的用途,。

免疫反應(yīng)

抗原和抗體結(jié)合發(fā)生的免疫反應(yīng)具有親和性和特異性，該反應(yīng)不是化學(xué)反應(yīng),，而是非共價鍵的相互作用,，主要包括疏水力、靜電引力,、范德瓦耳斯力和氫鍵作用力,，這些力的相互作用發(fā)生在側(cè)鏈或多肽鏈主干之間。

疏水力：抗原和抗體分子側(cè)鏈上的某些氨基酸是疏水性膠體,，在水溶液中不會與水分子形成氫鍵,，當(dāng)抗原決定簇靠近抗體活性結(jié)合位點時，疏水性氨基酸可排斥水分子形成疏水力,，促進二者之間的結(jié)合,。

靜電引力：抗原決定簇和抗體分子結(jié)構(gòu)中都含有氨基端（帶正電荷）和羧基端（帶負電荷)，帶有相反電荷的基團之間的靜電引力作用促使抗原和抗體相互結(jié)合,。

范德瓦耳斯力：分子與分子之間的作用力,，其作用效果主要取決于分子的空間構(gòu)型。

氫健作用力：指在具有親水基團（如羥基,、氨基、羧基）的抗體與相對應(yīng)的抗原相互接近時形成相對微弱和可逆的氫鍵橋梁,，促進抗原和抗體的結(jié)合,，該作用力比范德瓦耳斯力的結(jié)合力強且更具有特異性。

抗原和抗體的結(jié)合遵循可逆生物大分子相互作用的熱動力學(xué)基本原理,，平衡方程為：

式中,，K為平衡常數(shù)，是反映抗原與抗體結(jié)合能力的指數(shù),，又常稱為親和常數(shù),，范圍為10^6~10^12L/mol,；k1為正反應(yīng)速率常數(shù)：k2為負反應(yīng)速率常數(shù)；[Ab-Ag]為抗體-抗原結(jié)合物的摩爾濃度,；[Ab]和[Ag]分別為游離抗體或抗原的結(jié)合位點的摩爾濃度,。

當(dāng)抗原和抗體之間的親和力較強時，形成的抗原抗體結(jié)合物的結(jié)合牢固,，不易解離,；反之，結(jié)合物較易解離,。雖然抗體和抗原間的免疫反應(yīng)是可逆的,，但是在無外界因素的作用下，抗原-抗體結(jié)合物的自發(fā)解離通常非常緩慢,，在含有表面活性劑的高濃度無機鹽溶液中可以加速這一解離過程,。二

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 免疫分析是利用抗原與抗體之間高特異性的反應(yīng)（即免疫反應(yīng)）實現(xiàn)對抗體、抗原或相關(guān)物質(zhì)進行檢測的方法,。免疫分析方法分為競爭法和非競爭法,，其中，競爭法包括直接競爭法和間接競爭法,，非競爭法包括雙抗體夾心法及抗原和抗體直接結(jié)合法,。

1、間接競爭法

間接競爭法主要是針對半抗原的檢測,，因為常規(guī)的基于標(biāo)記的免疫分析方法不適合檢測小分子物質(zhì),。該方法通常將抗原與蛋白質(zhì)（如牛血清蛋白）的結(jié)合物固定在固相表面，待測液中游離的抗原與被固定的抗原競爭結(jié)合游離的過量抗體,，移去溶液中的抗原-抗體結(jié)合物,，標(biāo)記二抗再與固相表面的抗體（已和被固定的抗原結(jié)合)結(jié)合。標(biāo)記物可以是酶,、熒光或其他用于信號放大的物質(zhì),。 

圖片來源：IVD分享庫，Bin仔繪制

當(dāng)樣品中游離抗原的濃度較高時,，與固相載體表面固定的抗原結(jié)合的抗體就越少,，相應(yīng)地與之結(jié)合的標(biāo)記二抗就越少，標(biāo)記物產(chǎn)生的響應(yīng)信號（如電流）就越小,，由此建立響應(yīng)信號與目標(biāo)抗原濃度之間的關(guān)系,。該方法中一個抗體分子能同時結(jié)合多個二抗分子，使信號放大效果大大增強,，提高檢測的靈敏度,。該方法包含的主要步驟包括抗原抗體溫育、清洗,、二抗溫育,、信號檢測,。

2、直接競爭法

直接競爭法既可以基于抗原（或抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合物）的固定,，也可以基于抗體的固定,。在基于抗原的固定方式中，游離的抗原與被固定的抗原競爭結(jié)合標(biāo)記抗體,，經(jīng)過清洗步驟后檢測抗體標(biāo)記物所引起的響應(yīng)信號的變化,。與間接競爭免疫法相比，該方法對抗體進行標(biāo)記,，減少了使用標(biāo)記二抗結(jié)合的步驟,，但同時，標(biāo)記抗體的成本較高,，且不如標(biāo)記二抗的信號放大效果強,。） 

圖片來源：IVD分享庫，Bin仔繪制

同理,，在基于抗體固定的方式中,，游離的抗原和標(biāo)記抗原競爭結(jié)合被固定的抗體，經(jīng)過清洗步驟除去未結(jié)合的標(biāo)記抗原,。這種方法包含溫育,、清洗、信號檢測三個主要步驟,。該方法存在的問題在于,，當(dāng)目標(biāo)抗原濃度較低時，參與競爭的標(biāo)記抗原引起的信號響應(yīng)相對很大,，待測信號的變化很小,，使得檢測的靈敏度不高；另外,，該方法中使用的標(biāo)記物應(yīng)避免對游離抗原親和性的影響,。

3、雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是一種非競爭方法,，需要一抗和二抗兩種抗體,。二抗只能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，不能與一抗結(jié)合,。樣品中的抗原與固定在固相表面的抗體（即一抗）結(jié)合形成抗原-抗體結(jié)合物,，經(jīng)清洗后，標(biāo)記二抗與抗原結(jié)合,，形成“第一抗體-抗原-第二抗體"的雙抗夾心結(jié)構(gòu)，檢測標(biāo)記物產(chǎn)生的響應(yīng)信號,。

圖片來源：IVD分享庫,，Bin仔繪制

與競爭免疫分析模式相比,，該方法需要固相抗體與標(biāo)記二抗共同對目標(biāo)抗原進行特異性識別，減少了非特異性結(jié)合帶來的干擾,，因此該方法的特異性和靈敏度更高,，檢測下限更低。該方法一般適用于檢測生物大分子,，小分子抗原由于沒有足夠的結(jié)合位點同時結(jié)合一抗和二抗,，不適合采用該方法。

4,、抗原和抗體直接結(jié)合法

直接結(jié)合的非競爭免疫分析方法將抗體或抗原固定在固相表面,，待測抗原或抗體被捕獲后引起響應(yīng)信號的變化。該方法需要考慮非特異性吸附和背景干擾等問題,。

直接結(jié)合法示意圖