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RNA評價與鑒定
提取得到RNA溶液后，我們需要對RNA進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測,，以確
定它是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求,。RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對其質(zhì)
量要求不盡相同,。cDNA文庫構(gòu)建要求RNA完整且無酶等抑制物殘
留,；Northern blot實(shí)驗(yàn)對RNA完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘
留要求較低,；RT-PCR實(shí)驗(yàn)對RNA完整性要求不太高,，但對酶反應(yīng)
抑制物殘留要求嚴(yán)格,。因此在進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)時應(yīng)選擇不同的方法
純化RNA，以達(dá)到佳的實(shí)驗(yàn)效果,。
RNA得率檢測——分光光度計(jì)法
RNA得率有很強(qiáng)的組織特異性,，不同組織RNA的豐度和RNA提取的
難易程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說,，可通過分光
光度計(jì)測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計(jì)算RNA的含量,。RNA
溶液在260、320,、230,、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液
渾濁度,、雜質(zhì)（多肽,、苯酚等）濃度和蛋白等有機(jī)物的吸收值。用標(biāo)
準(zhǔn)樣品測得在波長260nm處,，1μg/ml RNA鈉鹽吸光度為0.025（光
程為1cm）,，即OD260=1時，樣品中RNA濃度為40μg/ml,。通常分光
光度計(jì)OD260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的,，因此RNA提
取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍,，再用分光光度計(jì)
檢測,。按下面的公式計(jì)算總RNA濃度：
總RNA濃度（μg/ml）= OD260×稀釋倍數(shù)× 40μg/ml
RNA純度檢測——分光光度計(jì)法
通過OD260/280來檢測RNA純度，OD260/230作為參考值,。
OD260/280在1.9-2.1之間,，可以認(rèn)為RNA的純度較好；
OD260/280值小于1.8,，則表明蛋白雜質(zhì)較多；
OD260/280值大于2.2,，則表明RNA已經(jīng)降解,；
OD260/230值小于2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙
醇?xì)埩簟?br />注意：如果用TE溶解或洗脫RNA,，會使OD260/280值偏大,。
RNA完整性鑒定——瓊脂糖凝膠電泳
變性電泳：
我們可以通過RNA變性電泳，來鑒定RNA的完整性,，但一般情況
下常規(guī)電泳檢測即可,。
RNA變性電泳方法如下：
1、凝膠制備：1.2％瓊脂糖凝膠
2,、上樣電泳
①電泳混合液的制備：
10×甲醛變性電泳緩沖液 1.25ul
37％甲醛 2.2ul
甲酰胺 6.25ul
②加入RNA
③混合后1000-2000rpm離心5-10秒
④55℃加熱15分鐘
⑤加入2.5 μ l甲醛凝膠上樣緩沖液,，混合后離心5秒
⑥將樣品加入點(diǎn)樣孔
⑦在5 V/cm的電壓下電泳至溴酚藍(lán)帶跑到電泳槽中央（20cm長電
泳槽,，95V電壓，1小時左右）,。
rRNA占總RNA的80-85％,，在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到
28S（23S）和18S（16S）rRNA。如28S rRNA的量約為18S rRNA的兩
倍,，說明RNA完整性較好,。
常規(guī)電泳：
由于變性電泳操作步驟較為復(fù)雜，所以在要求不太嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)
中,，RNA的檢測可以通過常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行,。一般1％
左右的凝膠就可以。按常規(guī)電泳配制好凝膠和電泳溶液,，總RNA
在普通瓊脂糖凝膠電泳上顯示條帶與變性電泳一致,。