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質(zhì)粒提取試劑盒簡介

閱讀:14647      發(fā)布時(shí)間:2010-1-11
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質(zhì)粒提取試劑盒簡介:
質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,,大小從1-200kb不
等,為雙鏈,、閉環(huán)的DNA分子,,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞
中。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌,、放線菌和真菌細(xì)胞中,,它具有自主復(fù)制
和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),,并表達(dá)所攜帶的
遺傳信息,。
質(zhì)粒提取原理及流程:
較常用的質(zhì)粒DNA提取方法有3種:堿裂解法、煮沸法和去污劑
(如Triton和SDS)裂解法,。前兩種方法比較劇烈,,適用于較小的質(zhì)粒
(<15kb)。去污劑裂解法則比較溫和,,一般用于分離大質(zhì)粒(>15kb),。
堿裂解法是一種應(yīng)用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法,其原理
為:染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多,,且染色體DNA為線狀分
子,,而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子;當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí),,
線狀染色體DNA容易發(fā)生變性,,共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性
時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象;變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞
碎片結(jié)合形成沉淀,,而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)
存在液相中,,離心去除沉淀后,就可從上清中回收質(zhì)粒DNA,。
目前,,市面上質(zhì)粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法,,
不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材
料,,其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上,,然后用
低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來。得到的質(zhì)??梢?br />用于酶切,、PCR、測序,、細(xì)菌轉(zhuǎn)化,、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
影響質(zhì)粒提取的因素:
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關(guān),,如宿主菌的種類和培養(yǎng)
條件,、細(xì)胞的裂解、質(zhì)??截悢?shù),、質(zhì)粒的穩(wěn)定性、抗生素,、吸附
柱的吸附量等,。
宿主菌種類
質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中,,多數(shù)情況下我們是
從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。大腸桿菌的菌株不同會(huì)影響質(zhì)粒提取的
質(zhì)量,。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA,。
HBl01和它的衍生菌株,如TG1和JM系列會(huì)在裂解時(shí)產(chǎn)生大量的糖
類,,如果沒有*去除,,將抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性,影響質(zhì)粒
DNA提取的質(zhì)量,。另外,,有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性,會(huì)降低
DNA的得率,。因此推薦使用DH5α和*0來提取質(zhì)粒DNA,。
培養(yǎng)時(shí)間
從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個(gè)單菌落,接種到培養(yǎng)物中(含有相關(guān)抗生
素的液體培養(yǎng)基中),,振蕩培養(yǎng)12-16小時(shí),。不應(yīng)超過16小時(shí),因?yàn)檫@時(shí)
細(xì)胞開始裂解,,使得質(zhì)粒的得率降低,,也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異,。
質(zhì)粒擴(kuò)增
氯霉素能抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,但對松弛型質(zhì)粒的
復(fù)制沒有影響,。因此,,在細(xì)菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)
粒的拷貝數(shù)。由于氯霉素抑制了宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,,
從而抑制了染色體的復(fù)制,,但質(zhì)粒復(fù)制所用的酶半衰期較長,故質(zhì)
粒仍可繼續(xù)復(fù)制,,這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量,,又可降低細(xì)胞的數(shù)量,
使細(xì)菌裂解液的粘度降低而便于操作,。常用于擴(kuò)增的氯霉素濃度為
170ug/ml ,。
抗生素
在菌株的各生長階段都應(yīng)加入抗生素篩選。現(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不
含有在細(xì)胞分裂時(shí)確保平均分配的par位點(diǎn),,無質(zhì)粒的子細(xì)胞在無
抗生素時(shí)復(fù)制速度遠(yuǎn)大于含質(zhì)粒的細(xì)胞,。

質(zhì)粒拷貝數(shù):
質(zhì)??截悢?shù)常用的定義是指生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基下每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中
所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目,。每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)
粒本身的起始復(fù)制機(jī)制。按照復(fù)制性質(zhì),,可以把質(zhì)粒分為兩類:一
類是嚴(yán)緊型質(zhì)粒,,當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時(shí),質(zhì)粒也復(fù)制一次,,每
個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有1-2個(gè)質(zhì)粒,,如F因子;另一類是松弛型質(zhì)粒,,當(dāng)染
色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制,,每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一般有20個(gè)左右質(zhì)
粒,如ColEl質(zhì)粒,。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型,,分子量較小的
質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復(fù)制有時(shí)和它們的宿主細(xì)胞有關(guān),,某些質(zhì)粒
在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型,,而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。
部分質(zhì)粒的拷貝數(shù)
質(zhì)粒種類 拷貝數(shù) 起始復(fù)制子 類型
pUC18/19載體 500-700 pMB1 高拷貝
pBluescript載體 300-500 ColE1 高拷貝
pGEM-T載體 300-400 pMB1 高拷貝
pTZ載體 >1000 pMB1 高拷貝
pBR322載體 15-20 pMB1 低拷貝
pACYC及其衍生載體 10-122 p1 低拷貝
pSC101及其衍生載體 5 pSC101 低拷貝
菌液收集及裂解
細(xì)菌收集可以通過離心來進(jìn)行,,不同的質(zhì)??截悢?shù),菌液量的需
求不同,,對于低拷貝的質(zhì)粒,,要相應(yīng)增加菌液的量,。菌液是在堿
性環(huán)境下裂解的,由于不同的宿主菌細(xì)胞壁厚薄的差異,,細(xì)胞的
破壁程度不同,,對于細(xì)胞壁較厚的宿主菌,首先要進(jìn)行破壁處理:
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理,,堿裂解時(shí)就能有效破壁
革蘭氏陽性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
菌液收集,、重懸以及宿主菌細(xì)胞破壁后,細(xì)胞在含有RNase A的
NaOH/SDS(溶液Ⅱ)中裂解,。SDS溶解細(xì)胞膜的磷脂和蛋白成分,,使
細(xì)胞的內(nèi)容物如染色體、質(zhì)粒DNA和蛋白在堿性環(huán)境下變性,。佳的
裂解時(shí)間是質(zhì)粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時(shí)間,,盡量縮短
質(zhì)粒暴露在變性環(huán)境中。長時(shí)間處在堿性環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒發(fā)生不可
恢復(fù)的變性,。變性的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上跑的較快,,而且不能被限制性
內(nèi)切酶消化。裂解產(chǎn)物在溶液Ⅲ中被調(diào)整到中性高鹽環(huán)境,,高鹽使得
變性的蛋白,、染色體DNA、細(xì)胞碎片和SDS都沉淀下來,,而質(zhì)粒復(fù)性
留在上清溶液中,。溶液要*混勻以確保沉淀*。為了防止染色體
DNA污染質(zhì)粒DNA,,要避免劇烈振蕩,,以防止染色體DNA被打斷,造
成對質(zhì)粒DNA的污染,。因?yàn)槿旧wDNA的片段和質(zhì)粒DNA在高鹽條件
下,都可以與硅膠膜結(jié)合,,在低鹽的條件下,,用洗脫液都能從膜上洗
脫下來。因此,,在裂解過程中要緩慢,、輕柔顛倒離心管。
質(zhì)粒DNA分離和純化:
純化要求
質(zhì)粒DNA中不應(yīng)存在對后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的酶活性有抑制作用的有機(jī)溶
劑分子或過高濃度的金屬離子,。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì),、多
糖、脂類,、基因組和RNA的污染,。不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對于質(zhì)粒純度的
要求不同,,常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(如酶切、測序等)普通純度的質(zhì)粒
即可滿足實(shí)驗(yàn),,而對于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),,要求質(zhì)粒的純度較高(如高純度或無
內(nèi)毒素)??梢赃x擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求,。
純化方法
用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式,提取的質(zhì)
粒純度高,、操作方便快捷,,可選擇的試劑盒有兩種類型,即普通質(zhì)
粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒,。
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
質(zhì)粒的保存
溶解在洗脫液TE中的質(zhì)粒DNA,,也可以貯存在TE緩沖液中(用水溶
解的質(zhì)粒只能短期保存,因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室用的純水呈弱酸性,,質(zhì)粒在
酸性環(huán)境下會(huì)發(fā)生磷酸解),,4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保
存,也可在含有質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物中,,加等體積甘油,,于-70℃保
存 。
質(zhì)粒鑒定與評價(jià):
瓊脂糖電泳檢測
堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定時(shí),,理想狀況是只出現(xiàn)
超螺旋—條帶,,但在質(zhì)粒提取過程中,由于機(jī)械力,、酸堿度,、試劑
等原因,使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂,,可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條
帶,,這三條帶電泳遷移率從快到慢,分別是超螺旋,、開環(huán)和復(fù)制中
間體(即沒有復(fù)制*的兩個(gè)質(zhì)粒粘連在—起),。如果加溶液Ⅱ后過
度振蕩,會(huì)在遠(yuǎn)離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶,,這條帶泳動(dòng)得較慢,,
是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是,,有時(shí)候提取的質(zhì)粒
會(huì)出現(xiàn)4個(gè)以上的條帶,,這是由于特殊的DNA序列導(dǎo)致了不同程度
的超螺旋(超螺旋的圈數(shù)不同)所致。但是,,只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定
后,,只有單一條帶,,就證明沒有基因組的污染。
酶切檢測
質(zhì)粒提取后,,為了進(jìn)—步鑒定質(zhì)粒的正確與否,,就要進(jìn)行酶切鑒
定,通過與Marker對比,,確定質(zhì)粒的分子量大小,。
用紫外線分光光度計(jì)檢測
濃度測定標(biāo)準(zhǔn)為:OD260值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好,。OD260/OD280比值
若低于1.7說明可能有蛋白污染,。OD260/OD280比值若高于2.0則說明
DNA有可能已降解。如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液,,而使用去離子
水,,比值會(huì)偏低,因?yàn)閜H值和離子濃度會(huì)影響光吸收值,,但并不表
示純度低,。

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