質(zhì)粒提取試劑盒簡介：
質(zhì)粒（Plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,，大小從1-200kb不
等,，為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞
中,。質(zhì)粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中,，它具有自主復制
和轉(zhuǎn)錄能力,，能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的
遺傳信息,。
質(zhì)粒提取原理及流程：
較常用的質(zhì)粒DNA提取方法有3種：堿裂解法,、煮沸法和去污劑
（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈,，適用于較小的質(zhì)粒
（<15kb）,。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒（>15kb）,。
堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法,，其原理
為：染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分
子,，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子,；當用堿處理DNA溶液時,，
線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性
時即恢復其天然構(gòu)象,；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞
碎片結(jié)合形成沉淀,，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)
存在液相中，離心去除沉淀后,，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA,。
目前，市面上質(zhì)粒提取試劑盒大多數(shù)都是采取上述的堿裂解方法,，
不同之處在于純化方式,。目前比較常用的純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材
料，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上,，然后用
低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來,。得到的質(zhì)粒可以
用于酶切,、PCR,、測序、細菌轉(zhuǎn)化,、轉(zhuǎn)染等分子生物學實驗,。
影響質(zhì)粒提取的因素：
質(zhì)粒提取的得率和質(zhì)量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養(yǎng)
條件,、細胞的裂解,、質(zhì)粒拷貝數(shù),、質(zhì)粒的穩(wěn)定性,、抗生素、吸附
柱的吸附量等,。
宿主菌種類
質(zhì)粒主要存在于細菌,、放線菌和真菌細胞中，多數(shù)情況下我們是
從大腸桿菌中提取質(zhì)粒,。大腸桿菌的菌株不同會影響質(zhì)粒提取的
質(zhì)量,。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA,。
HBl01和它的衍生菌株,，如TG1和JM系列會在裂解時產(chǎn)生大量的糖
類，如果沒有*去除,，將抑制后續(xù)實驗中的酶活性,，影響質(zhì)粒
DNA提取的質(zhì)量。另外,，有些菌株有非常高的內(nèi)切酶活性,，會降低
DNA的得率,。因此推薦使用DH5α和*0來提取質(zhì)粒DNA。
培養(yǎng)時間
從固體培養(yǎng)基平板上挑取一個單菌落,，接種到培養(yǎng)物中（含有相關抗生
素的液體培養(yǎng)基中）,，振蕩培養(yǎng)12-16小時。不應超過16小時,，因為這時
細胞開始裂解,，使得質(zhì)粒的得率降低，也會導致質(zhì)粒丟失或質(zhì)粒變異,。
質(zhì)粒擴增
氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA的合成,，但對松弛型質(zhì)粒的
復制沒有影響。因此,，在細菌培養(yǎng)液中加入氯霉素可提高松弛型質(zhì)
粒的拷貝數(shù),。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質(zhì)和DNA的合成，
從而抑制了染色體的復制,，但質(zhì)粒復制所用的酶半衰期較長,，故質(zhì)
粒仍可繼續(xù)復制，這樣既可增加質(zhì)粒產(chǎn)量,，又可降低細胞的數(shù)量,，
使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴增的氯霉素濃度為
170ug/ml ,。
抗生素
在菌株的各生長階段都應加入抗生素篩選?，F(xiàn)在用的許多質(zhì)粒都不
含有在細胞分裂時確保平均分配的par位點，無質(zhì)粒的子細胞在無
抗生素時復制速度遠大于含質(zhì)粒的細胞,。
質(zhì)?？截悢?shù):
質(zhì)粒拷貝數(shù)常用的定義是指生長在標準的培養(yǎng)基下每個細菌細胞中
所含有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目,。每個細胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)
粒本身的起始復制機制,。按照復制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一
類是嚴緊型質(zhì)粒,，當細胞染色體復制一次時,，質(zhì)粒也復制一次，每
個細胞內(nèi)只有1-2個質(zhì)粒,，如F因子,；另一類是松弛型質(zhì)粒，當染
色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制,，每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)
粒,，如ColEl質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴緊型,，分子量較小的
質(zhì)粒屬松弛型,。質(zhì)粒的復制有時和它們的宿主細胞有關,，某些質(zhì)粒
在大腸桿菌內(nèi)的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型,。
部分質(zhì)粒的拷貝數(shù)
質(zhì)粒種類 拷貝數(shù) 起始復制子 類型
pUC18/19載體 500-700 pMB1 高拷貝
pBluescript載體 300-500 ColE1 高拷貝
pGEM-T載體 300-400 pMB1 高拷貝
pTZ載體 >1000 pMB1 高拷貝
pBR322載體 15-20 pMB1 低拷貝
pACYC及其衍生載體 10-122 p1 低拷貝
pSC101及其衍生載體 5 pSC101 低拷貝
菌液收集及裂解
細菌收集可以通過離心來進行,，不同的質(zhì)粒拷貝數(shù),，菌液量的需
求不同,，對于低拷貝的質(zhì)粒，要相應增加菌液的量,。菌液是在堿
性環(huán)境下裂解的,，由于不同的宿主菌細胞壁厚薄的差異，細胞的
破壁程度不同,，對于細胞壁較厚的宿主菌,，首先要進行破壁處理：
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理，堿裂解時就能有效破壁
革蘭氏陽性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
菌液收集,、重懸以及宿主菌細胞破壁后,，細胞在含有RNase A的
NaOH/SDS（溶液Ⅱ）中裂解。SDS溶解細胞膜的磷脂和蛋白成分,，使
細胞的內(nèi)容物如染色體,、質(zhì)粒DNA和蛋白在堿性環(huán)境下變性。佳的
裂解時間是質(zhì)粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時間,，盡量縮短
質(zhì)粒暴露在變性環(huán)境中,。長時間處在堿性環(huán)境中會導致質(zhì)粒發(fā)生不可
恢復的變性。變性的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上跑的較快,，而且不能被限制性
內(nèi)切酶消化,。裂解產(chǎn)物在溶液Ⅲ中被調(diào)整到中性高鹽環(huán)境，高鹽使得
變性的蛋白,、染色體DNA,、細胞碎片和SDS都沉淀下來，而質(zhì)粒復性
留在上清溶液中,。溶液要*混勻以確保沉淀*,。為了防止染色體
DNA污染質(zhì)粒DNA，要避免劇烈振蕩,，以防止染色體DNA被打斷,，造
成對質(zhì)粒DNA的污染。因為染色體DNA的片段和質(zhì)粒DNA在高鹽條件
下,，都可以與硅膠膜結(jié)合,，在低鹽的條件下，用洗脫液都能從膜上洗
脫下來,。因此,，在裂解過程中要緩慢、輕柔顛倒離心管,。
質(zhì)粒DNA分離和純化：
純化要求
質(zhì)粒DNA中不應存在對后續(xù)實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶
劑分子或過高濃度的金屬離子,。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多
糖,、脂類,、基因組和RNA的污染。不同的后續(xù)實驗對于質(zhì)粒純度的
要求不同,，常規(guī)的分子生物學實驗（如酶切,、測序等）普通純度的質(zhì)粒
即可滿足實驗，而對于轉(zhuǎn)染實驗,，要求質(zhì)粒的純度較高（如高純度或無
內(nèi)毒素）,。可以選擇不同的質(zhì)粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求,。
純化方法
用硅基質(zhì)材料吸附質(zhì)粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式,，提取的質(zhì)
粒純度高、操作方便快捷,，可選擇的試劑盒有兩種類型,，即普通質(zhì)
粒提取試劑盒和無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒。
質(zhì)粒DNA的洗脫和收集
質(zhì)粒的保存
溶解在洗脫液TE中的質(zhì)粒DNA,，也可以貯存在TE緩沖液中（用水溶
解的質(zhì)粒只能短期保存,，因為實驗室用的純水呈弱酸性，質(zhì)粒在
酸性環(huán)境下會發(fā)生磷酸解）,，4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保
存,，也可在含有質(zhì)粒的細菌培養(yǎng)物中，加等體積甘油,，于-70℃保
存 ,。
質(zhì)粒鑒定與評價：
瓊脂糖電泳檢測
堿裂解法提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖電泳進行鑒定時，理想狀況是只出現(xiàn)
超螺旋—條帶,，但在質(zhì)粒提取過程中,，由于機械力、酸堿度,、試劑
等原因,，使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，可能出現(xiàn)兩條帶或者出現(xiàn)三條
帶,，這三條帶電泳遷移率從快到慢,，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中
間體（即沒有復制*的兩個質(zhì)粒粘連在—起）。如果加溶液Ⅱ后過
度振蕩,，會在遠離這三條帶的位置出現(xiàn)條帶,，這條帶泳動得較慢，
是大腸桿菌基因組DNA的片斷,。非常偶然的是,，有時候提取的質(zhì)粒
會出現(xiàn)4個以上的條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度
的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致,。但是,，只要質(zhì)粒經(jīng)單酶切鑒定
后，只有單一條帶,，就證明沒有基因組的污染,。
酶切檢測
質(zhì)粒提取后，為了進—步鑒定質(zhì)粒的正確與否,，就要進行酶切鑒
定,，通過與Marker對比，確定質(zhì)粒的分子量大小,。
用紫外線分光光度計檢測
濃度測定標準為：OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA,。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值
若低于1.7說明可能有蛋白污染,。OD260/OD280比值若高于2.0則說明
DNA有可能已降解,。如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子
水,，比值會偏低,，因為pH值和離子濃度會影響光吸收值，但并不表
示純度低,。
17
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務