ELISA KIT組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為1,600 pg/ml,，將其稀釋為400 pg/ml后,，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別稀釋成400 pg/ml,，200 pg/ml,，100 pg/ml，50 pg/ml,，25 pg/ml,，12.5 pg/ml，6.25 pg/ml,，樣品稀釋液直接作標(biāo)準(zhǔn)濃度0pg/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制200 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 400 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。
3. 樣品稀釋液：1×20ml,。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml,。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml。
6. 檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl/孔）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
11. 覆膜：5張
12. 使用說明書：1份
自備物品
1. 酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）
2. 微量加液器及吸頭,，EP管
3. 蒸餾水或去離子水，全新濾紙
標(biāo)本的采集及保存
1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3. 其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
4. 樣本處理：血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋5,000倍。
注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,，-20℃不應(yīng)超過1個月，-80℃不應(yīng)超過2個月,；標(biāo)本溶血會影響后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）,；試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時,，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘,。為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）,。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后立即進(jìn)行檢測,。
注：
1. 試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實驗操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染,。
2. 加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）好控制在10分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣,。
3. 孵育：為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度,。
4. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù),。
5. 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10μl），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6. 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù),。
7. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射,。
建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請后乘以稀釋倍數(shù),。
洗板方法
1. 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
2. 自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。
◇ 注意事項：
收集標(biāo)本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測的標(biāo)本,，儲存在4℃?zhèn)溆?，如有特殊原因需要周期收集?biāo)本，將標(biāo)本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存,。避免反復(fù)凍融,。標(biāo)本2-8℃可保存48小時，-20℃可保存1個月,。-70度可保存6個月,。部分激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。
◇ 液體類標(biāo)本：
標(biāo)本必須為液體,，不含沉淀,。包括血清、血漿,、尿液、胸腹水,、腦脊液,、細(xì)胞培養(yǎng)上清,、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿,。每個標(biāo)本量收集體積＝100ul×檢測種類,。取材前須向銷售人員索要說明書。
◇ 血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。收集上清。如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
◇ 血漿：
應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑,，加入10％（v/v）抗凝劑（0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2）混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
◇ 尿液,、胸腹水,、腦脊液：
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。
◇ 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。
◇ 組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS,，緩沖液中可加入1μg/L蛋白酶抑制劑或50U/ml的Aprotinin（抑肽酶）,。用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清置于-20度或- 70度保存,，如有必要，可以將樣品濃縮干燥,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。
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