新生兒促甲狀腺素（TSH）檢測試劑盒使用說明書

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新生兒促甲狀腺素（TSH）檢測試劑盒使用說明書

德國IBL進口原裝,，酶標(biāo)儀定量檢測

德國IBL中國*代理商“深圳科潤達生物工程有限公司”竭誠為您服務(wù)

中國SFDA注冊：國食藥監(jiān)械（進）字2011第2400471號

【產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號】SFDA（I）20112400471

用途

本試劑盒為體外測定試劑盒,，用酶聯(lián)免疫法定量測定濾紙片上干燥血標(biāo)本中的促甲狀腺素（hTSH），作為新生兒先天性甲狀腺機能減退癥（簡稱“甲低”）的篩查,。

前言

先天性“甲低”是以外周血甲狀腺激素（T3和T4）水平降低為特征的新生兒內(nèi)分泌障礙,。世界范圍內(nèi)先天性“甲低”的平均發(fā)病率為1：4，000,。此疾病特點是外周血中甲狀腺激素低于正常水平,，而促甲狀腺素高于正常水平。人的促甲狀腺素是由腦垂體前葉合成分泌的,。他調(diào)節(jié)和刺激甲狀腺產(chǎn)生甲狀腺激素。甲狀腺激素缺乏刺激hTSH分泌,，存在負(fù)反饋,。hTSH水平也受下丘腦分泌的促甲狀腺素釋放激素的影響。因此,，新生兒外周血促甲狀腺素濃度提高,，可作為篩查判斷先天性“甲低”的根據(jù)。

新生兒出生前后時期和出生后幾個月內(nèi)甲狀腺激素的不足將妨礙其大腦的正常發(fā)育,，其zui終結(jié)果是導(dǎo)致不可修復(fù)的大腦功能障礙和骨骼神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙,。早期篩查出新生兒先天性“甲低”，用甲狀腺激素的替代治療可防止大腦的發(fā)育不良,。

原理

1．新生兒促甲狀腺激素酶聯(lián)免疫測定法（Neonatal hTSH EIA）是一種固相雙位點酶免疫測定法,，濾紙片上干燥血標(biāo)本洗提出hTSH，同時與包被在酶標(biāo)板上抗hTSH的單克隆分子和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗hTSH亞單位的第二抗體結(jié)合,。

2．過剩的酶結(jié)合物和未結(jié)合的hTSH被洗滌去掉,，加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液進行酶反應(yīng)。

3．加入1N硫酸（H₂SO₄）溶液終止酶反應(yīng),，用酶標(biāo)讀數(shù)儀在450nm下測定吸光度值,。

試劑盒組成

試劑盒貯存在+2—+8℃。

不要使用過期試劑,。

試劑盒使用前,，所有試劑及酶標(biāo)板放置+18—+25℃平衡30分鐘。

TMB底物是光敏感性的,，應(yīng)避免光照,。

所有試劑組份一旦開啟,，密封袋或蓋子緊緊密封。

1 抗-hTSH包被的反應(yīng)板 10塊（12×8孔）

2 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物（濃縮100X） 2.5ml

3 酶結(jié)合物稀釋液 250ml

4a TMB顯色劑（25X） 9.5ml

4b 底物緩沖液 250ml

5 洗滌液（濃縮10X） 220ml

6 hTSH標(biāo)準(zhǔn)品 1張5套,，每套6個標(biāo)準(zhǔn)品,，用錫箔袋包裝。

每批標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值是不相同的,，每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值,。

7 hTSH質(zhì)控 C1-C2 1張5套，含2個質(zhì)控,，用錫箔袋包裝,。

每批質(zhì)控的數(shù)值是不相同的，每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值,。

8 終止液 0.45M 硫酸

酶標(biāo)反應(yīng)板的塑料粘膠貼 10張

質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品的TSH數(shù)值表 1張

試劑的準(zhǔn)備

表1 試劑的準(zhǔn)備

試劑	準(zhǔn)備	開啟或稀釋后的穩(wěn)定性（+2—+8℃）
1 抗-hTSH包被的反應(yīng)板	直接使用	2個月
2 辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物（濃縮）	臨用前,，用酶結(jié)合物稀釋液按1：100（1+99）稀釋配制。（見表2）	5個月廢棄未用完的酶結(jié)合物溶液
3 酶結(jié)合物稀釋液	供配制酶結(jié)合物溶液用	10個月
4 底物溶液	臨用前,，用底物緩沖液（4b）按1：25（1+24）將TMB顯色劑（4a）稀釋成底物溶液,。	廢棄未用完的底物溶液
4a TMB顯色劑	直接供配制底物溶液用	6個月
4b 底物緩沖液	直接供配制底物溶液用	6個月
5 洗滌液（濃縮）	用蒸餾水按1：10（1+9）稀釋	6個月廢棄有渾濁的洗滌液
6 hTSH標(biāo)準(zhǔn)品	直接使用	3個月
7 hTSH質(zhì)控 8 終止液	直接使用直接使用	3個月 6個月

表2酶結(jié)合物和底物溶液的準(zhǔn)備配制

酶標(biāo)板數(shù)（塊）	酶結(jié)合物（2）（ml）	酶結(jié)合物稀釋液（3）（ml）	TMB-顯色劑（4a）（ml）	底物緩沖液（4b）（ml）
1	0.24	24	1	24
2	0.42	42	2	48
3	0.62	62	3	72
4	0.82	82	4	96
5	1.00	100	5	120
6	1.20	120	6	144
7	1.38	138	7	168
8	1.58	158	8	192
9	1.76	176	9	216
10	2.00	200	10	240

試劑盒中未提供的所需器材

蒸餾水；量筒,；試劑瓶,；加樣槍；吸水紙,；計時器,；橡膠手套

—酶標(biāo)讀數(shù)儀如芬蘭Labsystems Multiskan

—板的振蕩器如芬蘭Labsystems iEMS Incubator/Shaker

—洗板機如芬蘭Labsystems Multiwash

—8-道加液器（50—300μl）

—（3mm）打孔器

標(biāo)本的收集和處理

嬰兒出生后3—5天，用濾紙從嬰兒的足跟取一滴血液,，獲得帶血點（直徑0.8cm）的濾紙片,，并確信濾紙片被血樣*浸透，帶血樣的濾紙片至少晾干2小時,，帶血樣的干燥濾紙片（密封）在+4--+8℃至少可貯存4個月時間,。

濾紙片標(biāo)本的收集一定是單一的一滴血液，否則會造成假陽性結(jié)果,。這一滴血在濾紙片上擴展的面積要足夠大,，保證血液從濾紙的上面均勻浸透到下面，浸透不* 會造成測定的TSH量偏低,。采血點應(yīng)稍微靠近足跟的左表面皮膚,，抹掉*滴血，用隨后形成的血滴,。為提高嬰兒足跟針刺點血流,，嬰兒足跟可用熱的（約 42℃）濕毛巾敷3分鐘。不要過分?jǐn)D壓足部，否則會導(dǎo)致溶血或組織液的稀釋,。一滴血形成后,，用濾紙片輕輕地接觸血滴，但不要向足跟擠壓,，從濾紙背面觀察血滴透過濾紙,。

一般一個嬰兒要收集三個血點（三滴血）的濾紙標(biāo)本，血樣點應(yīng)避免污染,。置濾紙于水平位置,，室溫空氣干燥2至6小時。注意不要加熱,，不要堆積,，不要接觸其他物品表面。將每個帶血標(biāo)本的濾紙片置于一個信封中,，并郵寄到新生兒篩查中心實驗室,。實驗室收到標(biāo)本應(yīng)放置+4--+8℃防濕保存，并及時篩查,。

標(biāo)本收集卡應(yīng)注明以下內(nèi)容：醫(yī)院名稱,，編號，嬰兒姓名,，出生年月日,，住院號，家庭地址,，和采血日期。

警告—有潛在生物危險的材料

標(biāo)準(zhǔn)品,，對照雖然已經(jīng)滅活,，但不能認(rèn)為無傳染性，應(yīng)認(rèn)為有潛在的傳染可能,。標(biāo)本等的處理按生物安全二級水平處理,。詳見美國疾病控制中心國立健康研究所的“微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全”手冊。（1984）

操作步驟

操作步驟簡圖

*步	用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品,，質(zhì)控和標(biāo)本,，并依次放置到包被板孔內(nèi)。
第二步	用酶標(biāo)記抗體稀釋液將酶標(biāo)記抗體按1：100倍稀釋,，每孔加入200μl,。室溫振動（650rpm）孵育2小時或室溫振動（650rpm）15分鐘后，+4℃不振動過夜,。
第三步	去掉標(biāo)本的濾紙片,，洗滌液洗滌4次，每次加入300ul,。
第四步	加入200μl的底物溶液室溫避光孵育15分鐘
第五步	加入100μl1N終止液在波長450nm下測定吸光度值,。

檢測前,，把所有的試劑和酶標(biāo)反應(yīng)板放置室溫+20--+25℃預(yù)熱30分鐘。

1.用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品（雙孔）,，質(zhì)控（雙孔）和標(biāo)本（每孔1片）,，并依次放置到抗-hTSH包被的酶標(biāo)板孔內(nèi)。

注意：圍繞血樣點中央對稱地打孔,。

2.用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體按1：100倍稀釋,，每孔加入200μl酶結(jié)合物溶液。

3.孵育

A：室溫（不超過+30℃）振動（650rpm）孵育2小時,。（貼上粘紙）

B：室溫振動15分鐘后,，+4℃不振動過夜。（貼上粘紙）

注意：當(dāng)室溫>+30℃時,，應(yīng)選擇過程B,。

4.倒去溶液和吸去濾紙片。

5.洗滌

——手工洗滌

每孔加入300μl的洗滌液（試劑5）,；

倒去,，拍盡液體；

重復(fù)操作4次,；

4次洗滌后,，輕輕倒拍幾次酶標(biāo)板，倒放在紙巾上一會兒,，吸盡殘液,。

——機器洗滌

洗滌液每孔400μl，重復(fù)洗滌4次,。

6.每孔加入200μl的底物溶液（試劑4a＋4b）,。

7.室溫（不超過+30℃）避光孵育30分鐘。（若室溫高于+30℃,，則避光孵育15分鐘,。）

8.每孔加入100μl1N終止液。

9.在450nm波長下測定各孔的吸光度值,。

結(jié)果

結(jié)果的計算：

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和標(biāo)本的濃度,。

質(zhì)量控制值

每批試劑盒的每套試劑盒內(nèi)都要一張單獨紙片，給出質(zhì)控的期望值,，只有質(zhì)控測定值在期望值范圍內(nèi),，結(jié)果才能被接受。

期望值和結(jié)果說明

對于正常的和假定的陽性之間的區(qū)別，是根據(jù)一個預(yù)定的臨界值,。臨界值是根據(jù)給定的正常人口hTSH值的參考范圍,，憑經(jīng)驗設(shè)定的，高于或接近臨界值的標(biāo)本建議復(fù)試,。

性能特點

敏感性 zui小濃度為0.9mIU/L

性

批內(nèi)分析

批內(nèi)分析不度

批間分析

批間分析不度

其他腦垂體激素和人絨毛膜促性腺激素干擾實驗

LH FSH HCG 干擾實驗檢測 在含10 mIU/LTSH血清中加入一定數(shù)量的每種激素,。

膽紅素干擾實驗

在濃度為0.05-10g/l,無干擾現(xiàn)象。

準(zhǔn)確性

用CDC質(zhì)控標(biāo)本檢測

臨床評估

labsystems公司的臨床評估分別在兩個不同的實驗室,。在上海新華醫(yī)院隨機抽查 10780名新生兒進行篩查,。樣品從剛剛出生三天的小孩采集。正常健康的嬰兒和甲低陽性的嬰兒濃度分布模式圖如下：

10780份新生兒樣品檢測分布圖,，預(yù)定的臨界值設(shè)置為10 mIU/L,。此預(yù)定值重測率僅為0.41%。

常見錯誤及糾正

低吸收值并且標(biāo)準(zhǔn)曲線很

原因	糾正
1試劑變質(zhì) 由于污染由于儲存不當(dāng)	1當(dāng)需要從一個試劑瓶中反復(fù)移液使用無菌操作技術(shù) 2根據(jù)說明書所述儲存試劑
2試劑沒有預(yù)熱到室溫	用溫度計檢查溫度
3反應(yīng)時間過短	根據(jù)說明書所述進行保溫
4讀數(shù)儀波長設(shè)置不正確	讀數(shù)波長應(yīng)為450nm
5讀數(shù)儀被設(shè)置成減去空白	重新設(shè)置讀數(shù)儀

高本底

原因	糾正
1由于吸液不充分引起的洗板不充分	1調(diào)節(jié)清洗頭 2檢查清洗頭是否被纖維堵塞
2保溫時間過長	根據(jù)說明書所述進行保溫
3保溫溫度過高	使用室溫振蕩15分鐘,4℃過夜的方式,底物保溫使用15分鐘.

低精密性

原因	糾正
只有標(biāo)準(zhǔn)曲線不好
標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控由于不恰當(dāng)?shù)膬Υ娑冑\|(zhì)	避免過度陽光和潮濕,將標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控同干燥劑密封在錫箔袋中,干燥劑應(yīng)是藍(lán)色的.
整板不好
1移液設(shè)備未正確校正	檢查與校正移液器
2由于洗頭的污染而導(dǎo)致不正確的洗板	經(jīng)常清潔清洗頭
3洗板后停留時間過長,板已干燥	根據(jù)說明書操作
只有病人樣品不好
樣品中血液的不平均分配	如果可能,應(yīng)使用被血液*浸透的樣品

操作注意事項

1.仔細(xì)閱讀試劑盒使用說明書,。

2.開始檢測前,，把試劑盒內(nèi)所有的試劑及酶標(biāo)板放置+20--+25℃平衡30分鐘。

3.不要使用超過有效期的試劑,，不要互用不同批號的試劑,，因為每批號試劑的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控值有可能不同，注意標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控的單位,，分清是血清還是全血,。

4.建議每塊板都使用標(biāo)準(zhǔn)品和對照。

5.檢測一旦開始,，隨后的步驟應(yīng)連續(xù)地進行下去,，不要中斷。

6.嚴(yán)格操作,，方能獲得理想的檢測結(jié)果,。應(yīng)準(zhǔn)確地使用加液器，不要使加液頭子接觸孔壁,，避免孔間污染；配制底物溶液等時,，所用的器具必須是潔凈的,，仔細(xì)地洗板是很重要的。

7.孵育時間的輕微變化是許可的,2小時±10分鐘,，20分鐘±5分鐘,。

8.TMB顯色劑必須在臨用前配制，TMB顯色劑是溶解在二甲基亞砜中的,，二甲基亞砜對眼睛和皮膚有刺激,，萬一接觸眼睛應(yīng)立即用清水沖洗，然后去醫(yī)院治療；接觸皮膚后應(yīng)立即用大量清水沖洗,；操作應(yīng)帶手套,；氧化劑，金屬離子和肥皂殘留物均能干擾TMB的反應(yīng),。TMB的熔點是18℃,，低于此溫度，易結(jié)晶,，使用前應(yīng)放置+18--+25℃平衡溶解后用底物緩沖液稀釋配制,。TMB顯色劑是光敏感性的，避免暴露在強光下,。

9.清洗玻璃容器時,，用1N的酸（HCL和H₂SO₄）*洗滌，然后用蒸餾水洗滌及遍,。

10. 結(jié)果一定要以吸光度來判斷,，不能憑目測判斷。

11. 本試劑盒應(yīng)貯存于+2--+8℃,。

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