苯丙氨酸（PKU）檢測試劑盒說明書

時間：2011/10/28閱讀：6009

苯丙氨酸（PKU）檢測試劑盒說明書

德國IBL進口原裝，酶標儀定量檢測

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中國SFDA注冊：國食藥監(jiān)械（進）字2010第3402924號

【產(chǎn)品標準編號】YZB/GEM 1401-2010

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：苯丙氨酸檢測試劑盒

商品名稱：苯丙氨酸檢測試劑盒

英文名稱：Phenylalanine （PKU） neonatal Screening Assay

【包裝規(guī)格】480人份/盒

【預期用途】

此試劑盒可用于新生兒血斑中L-苯丙氨酸的體外定量檢測,。僅供新生兒苯丙酮尿癥的篩查。

苯丙酮尿癥（PKU）,是一種zui常見的氨基酸代謝遺傳病,它通過常染色體隱性遺傳給子代,在人群中的發(fā)病率為1/2600—1/25000,。

發(fā)病的主要原因（90—99%病例）是苯丙氨酸羥化酶的活性降低或缺失,。苯丙氨酸羥化酶可以使必需氨基酸苯丙氨酸轉化為酪氨酸，后者是兒茶酚胺,、黑色素和甲狀腺激素的前體,，由于苯丙氨酸這個代謝的阻斷，因而通過旁路代謝轉化為苯丙酮酸和乙酸鹽,，通過腎臟排泄,。

該疾病由于在出生后*周,病人代謝抑制就表現(xiàn)出來。因為蛋白質(zhì)代謝的改變引起大腦神經(jīng)纖維異常的髓鞘形成對疾病的發(fā)展起主要作用,。苯丙酮尿癥的其它表現(xiàn)有（和附屬物）色素沉著的缺乏,。是因為黑色素形成的紊亂，因而引起皮膚病,。

在新生兒中對苯丙酮尿癥的診斷是重要的,因為可通過低苯丙氨酸膳食避免腦損害,。因而測定血中苯丙氨酸濃度的篩查試驗，應在出生后3—5天進行,，假如為陽性,，應通過檢測染色體特異的突變來進行確證試驗。

為了檢驗苯丙酮尿癥病人發(fā)展了許多篩查試驗,，zui早的試驗是由GUTHRIE 發(fā)明命名的,，以枯草桿菌的生長習性來檢測，枯草桿菌只能在高苯丙氨酸濃度生長,。因為該方法的許多缺陷被其它的一些試驗替代，這些實驗是利用病人血液中的苯丙氨酸參與的化學反應，利用熒光或顯色底物,，進行測定,。也可以應用更可信、更靈敏,、更的高壓液相色譜檢測,。

【檢驗原理】

將血斑紙上的苯丙氨酸用3%的三氯乙酸從濾紙上洗脫。

樣本中的苯丙氨酸在外加苯丙氨酸脫氫酶的作用下轉化成苯丙酮酸鹽,，此反應使存在于反應混合物中的輔酶NAD+再生,。產(chǎn)生的NADH 使加入的黃色Tetrazalium 鹽發(fā)生氧化還原反應生成紫色物質(zhì)Formazane，在570nm波長測定OD值,，OD值與病人樣本中的苯丙氨酸濃度成正比,。

【主要組成成分】

1、試劑盒成分

RE80015	標簽	成分
1×	ENZ LYO	酶,，凍干粉,，內(nèi)含苯丙氨酸脫氫酶，輔酶NAD+,，緩沖掖,，穩(wěn)定劑
1×45ml	ENZDIL	酶稀釋液，即用,，內(nèi)含二乙醇胺,，緩沖液，0.01%的NaN₃
1×55ml	SUBS	底物,，即用,，內(nèi)含四唑鹽和檸檬酸鹽。
1×5	CAL A-E	標準品A～E：1;3;6;12;18mg/dl,，用2.EWS進行校準,。內(nèi)含人血液，Schleicher & Schuell濾紙編號：903.15血斑紙片,。具體濃度請見試劑瓶標簽或質(zhì)控單,。
1×2	CONTROL 1+2	質(zhì)控品 1+2 質(zhì)控品1：1.8-3.0mg/dl 質(zhì)控品2：4.0-6.0mg/dl 內(nèi)含人血液，Schleicher & Schuell濾紙編號：903.15血斑紙片,。具體濃度及可接受范圍請見試劑瓶標簽或質(zhì)控單
1×2ml	DYE CONC	顯色儲存液,，51倍濃縮型，內(nèi)含酸性黃23（C.I.19140）

2,、實驗需要但試劑盒不提供器材

1）移液器（多道移液器或類似儀器：＜3% CV）,，體積：25;75;100;600;1000ul。

2）圓底聚苯乙烯試管（12×75mm）

3）試管架

4）試管振蕩器

5）三氯乙酸（3%,；w/v）,，用99.5%的三氯乙酸配得

6）0.5M的NaOH溶液

7）血液采集紙片（建議使用Schleicher & Schuell 903）

8）血斑打孔器,，5mm（1/5´´）（例如：Sauer，Hannover,，Germany）

9）微孔板（平底）

10）微孔板振蕩器（300-500rpm,，振幅：1.5-3.0mm）

11）可在570nm讀數(shù)的酶標儀（參比波長：690nm）

12）雙蒸水或去離子水

13）吸水紙，取樣吸頭和計時器

【儲存條件及有效期】

試劑盒應當儲存于2-8℃的環(huán)境下,，避免太陽直射,，有效期內(nèi)穩(wěn)定。樣品的儲存與穩(wěn)定及試劑的準備將在相關單元中說明,。有效期見試劑盒標簽,。

【使用儀器】通用酶標儀（配有570nm濾光片）

【樣本要求】

血斑

應當從嬰兒足跟的中部或內(nèi)測收集足跟血,注意血液采集的常規(guī)注意事項.刺破足跟后,*滴血應當用消毒紗布擦去.將采集卡對準血滴,讓足量的血滲入到吸水紙上并充分填滿預先印好的圓圈。重復操作,，將所需數(shù)目的血斑都制備好,。將血斑室溫下涼干3小時，避免太陽直射,。
注意	因為標準品是用Schleicher & Sshcuell No. 903濾紙確定的,，所以濾紙的材料會影響實驗結果，我們建議您也使用Sshleicher這種紙片,。采血時請勿擠壓穿刺部位,，因為擠壓會早成溶血或組織液稀釋血液。不要在采血圈內(nèi)連續(xù)滴血,。請勿接觸或涂抹血斑,。確保血斑樣品看上去符合實驗要求（例如：血無涂抹，無凝塊,，血斑上無指紋）,。
注意	樣品應當在嬰兒出生后第三天到第五天的時間內(nèi)采集。（出生后72到120小時內(nèi)）,。出生不到72小時就采集的樣品可能產(chǎn)生假陰性結果,。
儲存	2-8℃	避免熱源和太陽直射
穩(wěn)定性	6個月

【檢驗方法】

1、實驗準備

（1）酶儲存液的準備

注意	配置好的酶儲存液在2-8℃可穩(wěn)定存放5天,。準備實驗實際所需要的酶反應液即可,。
	在每支凍干的酶試劑瓶內(nèi)加入12ml雙蒸水，蓋好試劑瓶,，輕輕混合以使其充分溶解,，混合2分鐘，混合時避免起泡,。

（2）酶溶液的準備

注意

如果您使用了好幾支酶儲存液,，我們建議您將各管稀釋液混合并確定混合液的濃度.重新配置好的酶儲存液在18-25℃可穩(wěn)定存放8小時，儲存于2-8℃的環(huán)境下也不能延長它的有效期

酶溶液的建議配制量：

反應板數(shù)	1/3	2/3	1	2	3	4	5
酶儲存液（mL）	0.8	1.6	2.4	4.8	7.2	9.6	12
稀釋液（mL）	2.7	5.3	8.0	16	24	32	40

按照上述表格用稀釋液稀釋酶儲存液,，充分混合2min,，混合時避免起泡

（3）有色三氯乙酸（3%）的準備

用3%三氯乙酸按1：51的比例稀釋顯色儲存液（如：加2ml濃縮型的染色儲存液到100ml3%的三氯乙酸中,。配置好的三氯乙酸在18-25℃的環(huán)境下有效期內(nèi)穩(wěn)定。

（4）血斑的洗提

	用打孔器打下標準品,、質(zhì)控品和樣品血斑紙片（直徑5mm）,，分別放到相應的聚苯乙烯試管中，標上標簽
	在每一試管中加入100ul 3%三氯乙酸,，確保每一紙片都被溶液浸沒。
	振蕩器（300-500rpm,，振幅：1.5-3mm）上室溫（18-25℃）溫育30-60分鐘,。

2、實驗步驟

1	在微孔板的每一微孔中加入25ul 0.5M的NaOH溶液,。
2	將75ul標準品,、質(zhì)控品和血斑樣品洗提液分別加入到相應的微孔中,稍振板以便混合均勻
3	在每一微孔中加入100ul臨時配置好的酶溶液
4	室溫（18-25℃）下溫育30分鐘
5	在每一微孔中加入100ul底物溶液，振蕩器（300-500rpm,，振幅：1.5-3mm）上振蕩3分鐘
6	加入底物后3-5分鐘內(nèi)570nm處讀取OD值

【參考值（參考范圍）】

【檢驗結果的解釋】

1,、結果計算

以標準品的OD值為Y軸（線形）對標準品的濃度為X軸（對數(shù)）做一條標準曲線，標準曲線可用線形回歸曲線來做,。用計算機自動計算時,，用2點線形回歸方程得到的曲線。計算回歸曲線時,，用每一個標準品的數(shù)值來畫標準曲線（數(shù)值明顯偏離的應當忽略不要,，并使用更接近的數(shù)值來做標準曲線）。樣品的濃度可以從標準曲線上直接讀取,。樣品所顯示信號高于zui高標準品的必須用參考方法進行確認,。

轉換系數(shù)：1mg/dl=60.5μmol/L

典型標準曲線（范例，請勿用其定標）

標準品	苯丙氨酸（mg/dl）	平均OD值
A	0.61	0.039
B	2.61	0.074
C	5.81	0.108
D	11.61	0.186
E	17.61	0.283

2,、結果說明

如果血斑樣品中苯丙氨酸的濃度高于3.3mg/dl（=平均值+3倍的標準差）的樣品認為是“假陽性”樣品,，如果苯丙氨酸的期望值呈正態(tài)分布的話，則3%的受檢人群必須重復檢測,。如果再次檢測的結果仍高于3.3mg/dl,，則應當再采集新樣品并用證實實驗分析。關于新生兒篩查的各種團體都建議：TSH的重復檢測應使用不同的臨界值,，而且應當應用證實實驗,。鑒于每個實驗室都使用不同群體的新生兒樣品，我們強烈建議每個實驗室確定自己實驗室的正常值范圍,，而且其數(shù)值分布應當與當?shù)叵鄳鐣F體的建議數(shù)值一致,。實驗結果本身僅僅是確定治療結果的一個因素，它必須與臨床癥狀及診斷檢測相結合,。

【檢驗方法的局限性】

樣品的采集對實驗結果有明顯的影響,，具體如何采集樣品請見“樣品的采集與儲存”,。

篩查檢測中，血斑中苯丙氨酸濃度提高的結果都被認為是“假定陽性”樣品,，應當再次取樣并重新檢測,。不能*排除實驗中出現(xiàn)假陰性結果的可能。有苯丙酮尿癥既往病史或臨床癥候的樣品應當重復檢測,。如果苯丙酮尿癥的病人接受了藥物治療,，那么我們不能排除藥物對苯丙氨酸結果的直接影響。因此,，在上述那些情況下,，如果病人有苯丙酮尿癥的既往病史或臨床征候，我們強烈建議您用證實實驗確定正常的苯丙氨酸值,。建議血斑樣品取樣時使用S&S903濾紙片,。如果使用其它的濾紙片，應當考慮其相應的矯正因子,。例如,，使用2992濾紙片會使結果產(chǎn)生20%的不同：標準品（2992）=1.2×（S& S903）+0.181；相關系數(shù)=0.996,；數(shù)量=349

至于交叉反應,，請見“產(chǎn)品性能指標”。

如下血液成分濃度高于下述濃度時對實驗結果會產(chǎn)生明顯影響（±15%）：

血紅蛋白	5mg/dl
膽紅素	500mg/dl
甘油三酯	3000mg/dl

【產(chǎn)品性能指標】

分析特異性（交叉反應）	用有交叉反應的典型物質(zhì)檢測,，沒發(fā)現(xiàn)有交叉反應
靈敏度分析（檢測極限）	1.55mg/dl	靈敏度分析：20%,；y=26.33×^-0.6304 R²=0.82
精密度	范圍（mg/dl）	CV（％）
板內(nèi)差異	2.68-9.6	5.8-11.0
板間差異	2.79-9.36	6.4-15.1
線形度	樣品中苯丙氨酸濃度高于zui高標準品的應當用其它參考方法進行證實。樣本稀釋是不可能的,，因為稀釋用無苯丙氨酸血不存在,。而無苯丙氨酸的血液浸膏劑做稀釋液可能會產(chǎn)生基質(zhì)效應。
重現(xiàn)性	平均值（U/ml）	范圍（%）	加入已知濃度樣品后的重現(xiàn)性%
重現(xiàn)性	101	91-127	加入已知濃度樣品后的重現(xiàn)性%
與其它實驗方法比較	IBL檢測=0.88×其他檢測-0.21		r=0.95,；n=98

【注意事項】

1,、注意事項與預防措施

1）試劑僅供體外診斷和專業(yè)人士使用。

2）在檢測開始之前,，仔細和完整的閱讀說明書,，使用試劑盒提供的說明書的有效版本，確保所有的程序都清楚,。尋求更多信息（比如：臨床背景,，檢測操作，自動化操作說明,，可選擇的軟件,，文獻等等），請查看IBL公司主頁,。

3）如果試劑盒有破壞的請與IBL公司或供應商以書面方式,，但自您拿到試劑盒后zui遲不超過一個星期,。在檢測時請不要使用受損的試劑，以確保自身安全,。

4）按照批號和有效期,，不要混合使用不同批號的試劑，也不要使用過期的試劑,。

5）遵守實驗室優(yōu)化管理規(guī)則和安全指南,，穿實驗服，帶橡皮手套,，有必要時請戴護目鏡,。

6）這種試劑盒中含有會傷害眼睛和皮膚的有害試劑，請閱讀材料來源和標簽獲取詳細信息,。產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)能夠從IBL公司主頁上下載或直接向IBL公司索取。

7）根據(jù)國家生物有害物質(zhì)及安全條例,，所有化學藥品和準備或使用過的試劑都應當做有害物質(zhì)進行處理,。

8）此試劑中用到的標準品及質(zhì)控品的人血成分經(jīng)乙肝表面抗原，抗-HCV抗體,，抗-HIV1+2抗體檢驗結果應為陰性,，但是試劑中會出現(xiàn)此類病毒（HIV/II，HbsAg和HCV）或其他具有感染性的病原體的可能性都不能*被排除,。因此,，所有的試劑在使用和處理的過程中都應當作潛在生物有害物質(zhì)進行處理。

2,、實驗操作注意事項：

1）樣品的不合理處理及實驗操作的任何改動都將影響實驗的結果,。取樣體積、溫育時間,、預處理步驟都必須嚴格按說明進行,。只能使用標準取樣器和標準設備。

2）一旦實驗開始,，所有的步驟都必須完整的進行下去,，不允許中斷。把所有試劑和樣品都拿到18-25℃的實驗室中,，在使用前,，輕輕搖動液體試劑和樣品，試劑混合過程中要避免氣泡,。

3）請勿接觸試劑,、取樣器、微孔/試管,。加試劑和樣本時,，請使用新的取樣吸頭,，以避免交叉污染。不用的試劑應用蓋子蓋好,，以免重復使用,。

4）為了消除潛在的加樣誤差，建議每份樣品都做雙份檢測,。

5）用加液記錄表格核對反應板上的排列順序,。

6）溫育時間會影響實驗結果。微孔加樣的順序和時間都必須一致,。建議使用8道移液器向微孔加樣,。

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