等組成,。其中輸液泵、色譜柱,、檢測(cè)器是關(guān)鍵部件,。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī),、自動(dòng)進(jìn)樣器,、預(yù)柱或保護(hù)柱,、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng),，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理,。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。
zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵,、低效的柱,、固定波長的檢測(cè)器、繪圖儀,，繪出的峰是通過手工測(cè)量計(jì)算峰面積,。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型,，檢測(cè)器從單波長至可變波長檢測(cè)器,、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測(cè)器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測(cè)器,。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀,，逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀、計(jì)算機(jī),、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng),。
輸液泵是HPLC系統(tǒng)中zui重要的部件之一,。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性,。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%,，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要,；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10
ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào),，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min,；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2,；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕,。
泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵,。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵,、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定,；螺旋泵缸體太大,，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用zui多的是柱塞往復(fù)泵,。
柱塞往復(fù)泵的液缸容積小,，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動(dòng)相,，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫,；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響,；泵壓可達(dá)400kg/cm2,。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服,。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式,，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%）,，但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴,。
①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會(huì)磨損柱塞,、密封環(huán)、缸體和單向閥,，因此應(yīng)預(yù)先除去流動(dòng)相中的任何固體微粒,。流動(dòng)相在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過,，可采用Millipore濾膜（0.2µm或0.45µm）等濾器,。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換,。
②流動(dòng)相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì),，含有緩沖液的流動(dòng)相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時(shí)間的情況下,。如果將含緩沖液的流動(dòng)相留在泵內(nèi),，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置,，就可能析出鹽的微細(xì)晶體,，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此,，必須泵入純水將泵充分清洗后,，再換成適合于
③泵工作時(shí)要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相被用完,，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會(huì)磨損柱塞,、缸體或密封環(huán)，zui終產(chǎn)生漏液,。
⑤流動(dòng)相應(yīng)該先脫氣,，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性,，如果有大量氣泡,，泵就無法正常工作。
①?zèng)]有流動(dòng)相流出，又無壓力指示,。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體,，這時(shí)可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn),，將氣泡排盡,，也可用一個(gè)50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個(gè)可能原因是密封環(huán)磨損,，需更換,。
②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡,，需要排除,；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥,，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗,。有時(shí)可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡,，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯@時(shí),，可卸下砂濾棒浸入流動(dòng)相內(nèi)超聲除氣泡,，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內(nèi)迅速除去微生物,，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。
HPLC有等強(qiáng)度（isocratic）和梯度（gradient）洗脫兩種方式,。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少,，性質(zhì)差別不大的樣品,。梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性,、離子強(qiáng)度和pH值等,，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品,。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間,，提高分離度，改善峰形,，提高檢測(cè)靈敏度,，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。
兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合,，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度,、凸形梯度和階梯形梯度,。線性梯度zui常用,，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫,。
①要注意溶劑的互溶性,，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相,。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶,，使用時(shí)更要引起注意,。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時(shí)，還可能析出鹽的晶體,，尤其使用磷酸鹽時(shí)需特別小心,。
②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫,，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰,，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會(huì)被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需*脫氣,，以防止混合時(shí)產(chǎn)生氣泡,。
③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化,。例如甲醇和水粘度都較小,，當(dāng)二者以相近比例混合時(shí)粘度增大很多，此時(shí)的柱壓大約是甲醇或水為流動(dòng)相時(shí)的兩倍,。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的zui大壓力,。
④每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài),。需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱,，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到*平衡。
二,、進(jìn)樣器
早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器,，裝在色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器,。進(jìn)樣裝置要求：密封性好,，死體積小，重復(fù)性好,，保證中心進(jìn)樣,，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小,。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣,、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣,、自動(dòng)進(jìn)樣,。
1．隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi),，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心,，死體積幾乎等于零，可以獲得*的柱效,，且價(jià)格便宜,，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）,；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng),，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%,；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制,。
2．停流進(jìn)樣,。可避免在高壓下進(jìn)樣,。但在HPLC中由于隔膜的污染,，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)"鬼峰"；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn),。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中,，效果較好。
3．閥進(jìn)樣,。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見）,，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在,，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右）,，但耐高壓（35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確,，重復(fù)性好（0.5%）,，操作方便。
六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和*裝液法兩種,。①用部分裝液法進(jìn)樣時(shí),，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的50%（zui多75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確,、相同,。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬,。②用*裝液法進(jìn)樣時(shí),，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10倍（zui少3倍），這樣才能*置換定量環(huán)內(nèi)的流動(dòng)相,，消除管壁效應(yīng),，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性,。
六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45µm濾膜過濾,，以減少微粒對(duì)進(jìn)樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動(dòng)閥芯時(shí)不能太慢,，更不能停留在中間位置,，否則流動(dòng)相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增,，甚至超過泵的zui大壓力,；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時(shí),，過高的壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中,，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥,。通常可用水沖洗,，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗,，再用水沖洗。
4．自動(dòng)進(jìn)樣,。用于大量樣品的常規(guī)分析,。
三、色譜柱
色譜是一種分離分析手段,，分離是核心,，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對(duì)色譜柱的要求是柱效高,、選擇性好,，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相,、氧化鋁,、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等,，其粒度一般為3,5,7,10μm等,，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效,；對(duì)于同系物分析,，只要500即可；對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬的柱子,，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要,。
柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到*效率,，除柱外死體積要小外,，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使的裝填技術(shù),，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流,，流速較快,，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬,，這就是管壁效應(yīng),。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度,。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng),。
1．柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管,、壓帽、卡套（密封環(huán)）,、篩板（濾片）,、接頭、螺絲等組成,。柱管多用不銹鋼制成,，壓力不高于70
kg/cm2時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管,，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度,。為提高柱效，減小管壁效應(yīng),，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光,。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同,。還有使用熔融硅或玻璃襯里的,，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板,，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金,，孔徑0.2~20µm（5~10µm），取決于填料粒度,，目的是防止填料漏出,。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱）,，內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm,，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長10~30cm,；②窄徑柱（narrow
bore,，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn）,，內(nèi)徑1~2mm,，柱長10~20cm；③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn）,，內(nèi)徑0.2~0.5mm,；④半制備柱,，內(nèi)徑＞5mm,；⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱,，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm,；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米,。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定,，目的是為了避免管壁效應(yīng),。
2．柱的發(fā)展方向
因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm,，填料粒徑2~3µm,。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜（MS）聯(lián)接,，而發(fā)展出窄徑柱,、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相,；②靈敏度增加,；③樣品量少；④能使用長柱達(dá)到高分離度,；⑤容易控制柱溫,；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。
但由于柱體積越來越小,，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著,，需要更小池體積的檢測(cè)器（甚至采用柱上檢測(cè)），更小死體積的柱接頭和連接部件,。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量,，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品,。且因上樣量小,，要求高靈敏度的檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn),。
3．柱的填充和性能評(píng)價(jià)
色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外,，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下,，填料粒度＞20µm時(shí),，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20µm時(shí),，濕法填充較為理想,。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充,；②徑向加壓法,，Waters,；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱,；④干法,。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱,。
必須指出,，液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié),，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣,，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱,，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察,，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品,、流動(dòng)相,、流速、溫度）下的柱壓,、理論塔板高度和塔板數(shù),、對(duì)稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性,，或分離度,。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí),，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化,。
一份合格的
色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長,、內(nèi)徑,、填料的種類、粒度,、色譜柱的柱效,、不對(duì)稱度和柱壓降等。
4．柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)
色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要,，稍有不慎就會(huì)降低柱效,、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中,，需要注意下列問題,，以維護(hù)色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況,；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料,，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩（如前所述）,。
② 應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成,，特別是反相色譜中,，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?
③ 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí),，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì),。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH）,，以避免固定相被破壞,。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí),，預(yù)柱為硅膠,，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解,。
⑤ 避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi),，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱,。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換,。
⑥ 經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì),。在進(jìn)行清洗時(shí),，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右,，即常規(guī)分析需要50~75ml,。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）,、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水,。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì),，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水,、甲醇,、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗,。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液,，那么可以省略zui后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì),，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200µl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì),。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次,。此外,，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染,。
陽離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗,，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽,，然后用水,、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）,、甲醇,、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇,，柱接頭要擰緊,，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間,。
⑧
色譜柱使用過程中,，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞,，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗,；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染,；如果柱效降低或色譜峰變形,，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大,。
在后兩種情況發(fā)生時(shí),，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平,。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱,，壓平，再擰緊柱接頭,。這樣處理后柱效能得到改善,，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm）,，可以起到保護(hù),、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效,，這是值得的,。
通常
色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上。以硅膠為基質(zhì)的填料,，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用,。柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂,，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙?。新的色譜柱在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷,，使柱效下降,，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)。
每次工作完后,，用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗,，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí),，使用完后應(yīng)用無鹽流動(dòng)相沖洗,。含鹵族元素（氟、氯,、溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道,，不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用,，應(yīng)每隔4~5天開機(jī)沖洗15分鐘,。
四、檢測(cè)器
檢測(cè)器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一,。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),。HPLC的檢測(cè)器要求靈敏度高、噪音低（即對(duì)溫度,、流量等外界變化不敏感）,、線性范圍寬、重復(fù)性好和適用范圍廣,。
1．分類
1）按原理可分為光學(xué)檢測(cè)器（如紫外,、熒光、示差折光,、蒸發(fā)光散射）,、熱學(xué)檢測(cè)器（如吸附熱）、
電化學(xué)檢測(cè)器（如極譜、庫侖,、安培）,、電學(xué)檢測(cè)器（電導(dǎo)、介電常數(shù),、壓電石英頻率）,、
放射性檢測(cè)器（閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲,、氦離子化）以及氫火焰離子化檢測(cè)器,。
2）按測(cè)量性質(zhì)可分為通用型和專屬型（又稱選擇性）。通用型檢測(cè)器測(cè)量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì),，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng),，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,。通用型的靈敏度一般比專屬型的低,。專屬型檢測(cè)器只能檢測(cè)某些組分的某一性質(zhì)，如紫外,、熒光檢測(cè)器,，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng)。
3）按檢測(cè)方式分為濃度型和質(zhì)量型,。濃度型檢測(cè)器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān),，質(zhì)量型檢測(cè)器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過檢測(cè)器的組分的量有關(guān)。
4）檢測(cè)器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種,。
2．性能指標(biāo)
1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后,，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音,，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移,。它們反映檢測(cè)器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響,，如果有流動(dòng)相從
色譜柱流入檢測(cè)器,，那么它們還反映流速（泵的脈動(dòng)）和溶劑（純度、含有氣泡,、固定相流失）的影響,。噪音和漂移都會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小,。
2）靈敏度（sensitivity）：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測(cè)器時(shí)所給出的信號(hào)大小,。對(duì)濃度型檢測(cè)器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小,，單位為mV·ml/g,。對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器,，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過檢測(cè)器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV·s/g,。
3）檢測(cè)限（detection limit）
檢測(cè)器靈敏度的高低,，并不等于它檢測(cè)zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低，因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí),，沒有考慮噪聲的大小,，而檢測(cè)限與噪聲的大小是直接有關(guān)的。
檢測(cè)限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)（通常用2倍或3倍噪音表示）時(shí)進(jìn)入檢測(cè)器的某組分的量（對(duì)濃度型檢測(cè)器指在流動(dòng)相中的濃度--注意與分析方法檢測(cè)限的區(qū)別,，單位g/ml或mg/ml,；對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測(cè)器的量，單位g/s或mg/s）,。又稱為敏感度（detectability）,。D＝2N/S，式中N為噪聲,，S為靈敏度,。通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測(cè)器中來測(cè)定其檢測(cè)限的大小。
檢測(cè)限是檢測(cè)器的一個(gè)主要性能指標(biāo),，其數(shù)值越小,，檢測(cè)器性能越好,。值得注意的是,，分析方法的檢測(cè)限除了與檢測(cè)器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件,、
色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān),。
4）線性范圍（linear
range）：指檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下,，zui大與zui小進(jìn)樣量（濃度型檢測(cè)器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比,。也可用響應(yīng)信號(hào)的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters
996 PDA檢測(cè)器的線性范圍是-0.1~2.0A,。
定量分析的準(zhǔn)確與否,，關(guān)鍵在于檢測(cè)器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測(cè)樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系。輸出信號(hào)與樣品量呈線性關(guān)系,，這樣進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)既準(zhǔn)確又方便,。但實(shí)際上沒有一臺(tái)檢測(cè)器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng)。通常A＝BCx,，B為響應(yīng)因子,，當(dāng)x=1時(shí)，為線性響應(yīng),。對(duì)大多數(shù)檢測(cè)器來說,，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1,，實(shí)際上通常只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的。
線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定,。我們希望檢測(cè)器的線性范圍盡可能大些,，能同時(shí)測(cè)定主成分和痕量成分。此外還要求池體積小,，受溫度和流速的影響小,，能適合梯度洗脫檢測(cè)等。
5）池體積：除制備色譜外,，大多數(shù)HPLC檢測(cè)器的池體積都小于10µl,。在使用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到1~2µl甚至更低,，不然檢測(cè)系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張問題就會(huì)很嚴(yán)重,。而且這時(shí)池體、檢測(cè)器與色譜柱的連接,、接頭等都要精心設(shè)計(jì),，否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。
3．紫外檢測(cè)器（ultraviolet detector）
UV
檢測(cè)器是HPLC中應(yīng)用zui廣泛的檢測(cè)器,，當(dāng)檢測(cè)波長范圍包括可見光時(shí),，又稱為紫外-可見檢測(cè)器。它靈敏度高,，噪音低,，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度均不敏感,，可于制備色譜,。由于靈敏高，因此既使是那些光吸收小,、消光系數(shù)低的物質(zhì)也可用UV檢測(cè)器進(jìn)行微量分析,。但要注意流動(dòng)相中各種溶劑的紫外吸收截止波長。如果溶劑中含有吸光雜質(zhì),，則會(huì)提高背景噪音,，降低靈敏度（實(shí)際是提高檢測(cè)限）。此外,，梯度洗脫時(shí),，還會(huì)產(chǎn)生漂移。
注：將溶劑裝入1cm的比色皿,，以空氣為參比,，逐漸降低入射波長，溶劑的吸光度A＝1時(shí)的波長稱為溶劑的截止波長,。也稱極限波長,。
中國藥典對(duì)UV法溶劑的要求是：以空氣為空白,，溶劑和吸收池的吸收度在220~240nm范圍內(nèi)不得超過0.40，在241~250nm范圍內(nèi)不得過0.20,，在251~300nm范圍內(nèi)不得過0.10,，在300nm以上不得過0.05。
UV檢測(cè)器的工作原理是Lambert-Beer定律,，即當(dāng)一束單色光透過流動(dòng)池時(shí),，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動(dòng)池的光徑長度L成正比.
UV檢測(cè)器分為固定波長檢測(cè)器,、可變波長檢測(cè)器和光電二極管陣列檢測(cè)器（photodiode array
detector,，PDAD）。按光路系統(tǒng)來分,，UV檢測(cè)器可分為單光路和雙光路兩種,。可變波長檢測(cè)器又可分單波長（單通道）檢測(cè)器和雙波長（雙通道）檢測(cè)器,。PDAD是80年代出現(xiàn)的一種光學(xué)多通道檢測(cè)器,，它可以對(duì)每個(gè)洗脫組分進(jìn)行光譜掃描，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后,，得到光譜和色譜結(jié)合的三維圖譜,。其中吸收光譜用于定性（確證是否是單一純物質(zhì)），色譜用于定量,。常用于復(fù)雜樣品（如生物樣品,、中草藥）的定性定量分析。
4．與檢測(cè)器有關(guān)的故障及其排除
1）流動(dòng)池內(nèi)有氣泡
如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動(dòng)池,，將使噪音增大,，如果氣泡較大，則會(huì)在基線上出現(xiàn)許多線狀"峰",，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣,，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣,，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi),，也可能使噪音增大,，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（不連接色譜柱）；或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí),，用手指緊壓流動(dòng)池出口,，使池內(nèi)增壓，然后放開,?？煞磸?fù)操作數(shù)次,，但要注意不使壓力增加太多，以免流動(dòng)池破裂,。
2）流動(dòng)池被污染
無論參比池或樣品池被污染,，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當(dāng)溶劑清洗檢測(cè)池,，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重,，就需要依次采用1mol/L硝酸,、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗,、更換窗口,。
3）光源燈出現(xiàn)故障
紫外或熒光檢測(cè)器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音,，基線漂移,，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零,。這時(shí)需要更換光源燈,。
4）倒峰
倒峰的出現(xiàn)可能是檢測(cè)器的極性接反了，改正后即可變成正峰,。用示差折光檢測(cè)器時(shí),，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰,，這就需要選擇合適的流動(dòng)相,。如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測(cè)器時(shí),，無吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰,，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化,，或者由于樣品溶劑與流動(dòng)相不同所引起的,。
五、數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測(cè)信號(hào),，再手工測(cè)量計(jì)算,。其后，使用積分儀計(jì)算并打印出峰高,、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù),。80年代后，計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速,、簡便,、準(zhǔn)確,、精密和自動(dòng)化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù),。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：①采集,、處理和分析數(shù)據(jù)；②控制儀器,；③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng),。
六、恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測(cè)器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度,，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間,，檢測(cè)器的恒溫要求則更高。
溫度對(duì)溶劑的溶解能力,、色譜柱的性能,、流動(dòng)相的粘度都有影響。一般來說,，溫度升高,，可提高溶質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K,，但對(duì)分離選擇性影響不大,；還可使流動(dòng)相的粘度降低，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓,。但溫度太高易使流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡,。
色譜柱的不同工作溫度對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間都有影響,。在凝膠色譜中使用軟填料時(shí)溫度會(huì)引起填料結(jié)構(gòu)的變化,，對(duì)分離有影響；但如使用硬質(zhì)填料則影響不大,。
總的說來,，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對(duì)分離的影響并不顯著,，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作,。在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì)（如緩沖劑）加入流動(dòng)相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時(shí)溫度對(duì)保留值的影響很大,。
不同的
檢測(cè)器對(duì)溫度的敏感度不一樣。紫外檢測(cè)器一般在溫度波動(dòng)超過±0.5℃時(shí),，就會(huì)造成基線漂移起伏,。示差折光檢測(cè)器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度，因此需控制在±0.001℃左右,，微吸附熱檢測(cè)器也要求在±0.001℃以內(nèi),。
