人氧化型谷胱甘肽(GSSG)ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供體外研究使用
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中GSSG含量,。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗GSSG抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗GSSG抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GSSG呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),,計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
- 酶聯(lián)板:一塊(96孔)
- 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品):2瓶,,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,,其濃度為50 nmol/mL,做系列倍比稀釋后,,分別稀釋成50 nmol/mL,,25 nmol/mL,12.5 nmol/mL,,6.25 nmol/mL,,3.12 nmol/mL,1.56 nmol/mL,,0.78 nmol/mL,,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 nmol/mL,臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制25 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 50 nmol/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,,混勻即可,其余濃度以此類推,。
- 樣品稀釋液:1×20ml/瓶,。
- 檢測稀釋液A:1×10ml/瓶。
- 檢測稀釋液B:1×10ml/瓶。
- 檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,,稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制(100ul/孔),,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,,輕輕混勻,,在使用前一小時內(nèi)配制。
- 檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。
- 底物溶液:1×10ml/瓶。
- 濃洗滌液:1×30ml/瓶,,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
- 終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
標(biāo)本的采集及保存
- 血清:全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘,,取上清即可檢測,,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
- 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,,但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
- 其它生物標(biāo)本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,,或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,,-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,,-20℃不應(yīng)超過1個月,-80℃不應(yīng)超過2個月,;標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測;高血脂的標(biāo)本不需進(jìn)行特殊處理,,可直接檢測,。
操作步驟
實驗開始前,請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時,,均需混勻,,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時,,均應(yīng)用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前*行預(yù)實驗以建立*稀釋倍數(shù),。
- 加樣:分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,??瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,,注意不要有氣泡,,加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘,。
為保證實驗結(jié)果有效性,,每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
- 棄去液體,,甩干,,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時內(nèi)配制),,37℃,60分鐘,。
- 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,,甩干,,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,,350ul/每孔,,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
- 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,,37℃,60分鐘,。
- 溫育60分鐘后,,棄去孔內(nèi)液體,甩干,,洗板5次,,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干),。
- 依序每孔加底物溶液90ul,,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,,后3-4孔梯度不明顯,,即可終止)。
- 依序每孔加終止溶液50ul,,終止反應(yīng),,此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
- 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值),。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測,。
注:
- 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔),該孔不加任何試劑,,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
- 嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑。
- 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),,酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,,避免酶標(biāo)板長時間處于干燥狀態(tài),。
- 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值,。
- 在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
- 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,,請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10ul),,以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差,;檢測液A,、B,以及底物溶液在使用前,,應(yīng)置于37℃溫育30分鐘,;請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
- 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,,以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,;在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙,,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),,浸泡1-2分鐘,,根據(jù)需
要,重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板:如果有自動洗板機,,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人GSSG,,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),,在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,,如curve expert 1.3),根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,,再乘以稀釋倍數(shù),;或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,,計算出樣品濃度,,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度,。
注意事項
- 洗滌過程非常重要,,不充分的洗滌易造成假陽性。
- 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),,如標(biāo)本數(shù)量多,,推薦使用多道移液器加樣。
- 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,,做復(fù)孔。
- 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,,請先稀釋后再測定,,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
- 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,,請以相應(yīng)的稀釋液配制,,不能混淆。
- 底物請避光保存,。
檢測范圍:0.78 nmol/mL - 50 nmol/mL
zui低檢測限:0.25 nmol/mL
說明
- 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,,因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
- 小心吸取試劑并嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,,酶結(jié)合物或底物時,,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間,,從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且,洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。
- 試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,,部分試劑保存于2-8℃,具體以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn),。
- 濃洗滌液會有鹽析出,,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
- 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),,此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
- 中,、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準(zhǔn),。
- 所有的樣品都應(yīng)管理好,,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
- 有效期:6個月