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人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)ELISA試劑盒使用說明書

時間:2016/3/28閱讀:115
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人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中氧化低密度脂蛋白(OxLDL)含量,。

 

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,,往包被抗OxLDL抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗OxLDL抗體、HRP標記的親和素,,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的OxLDL呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),,計算樣品濃度。 

 

試劑盒組成及試劑配制 

  • 酶聯(lián)板:一塊(96孔) 
  • 標準品(凍干品):2瓶,,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,,其濃度為80 ng/ml,,將其稀釋為20 ng/ml后,,再做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋)后,,分別稀釋成20 ng/ml10 ng/ml,,5 ng/ml,,2.5 ng/ml1.25 ng/ml,,0.625 ng/ml,,0.312 ng/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,,臨用前15分鐘內(nèi)配制,。如配制10 ng/ml標準品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 20 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,,其余濃度以此類推,。
  • 樣品稀釋液1×20ml
  • 檢測稀釋液A1×10ml,。
  • 檢測稀釋液B1×10ml,。
  • 檢測溶液A1×120μl1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100μl/孔),,實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl檢測溶液A990μl檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,,在使用前一小時內(nèi)配制,。
  • 檢測溶液B1×120μl/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
  • 底物溶液1×10ml/瓶,。 
  • 濃洗滌液1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。 
  • 終止液1×10ml/瓶(2N H2SO4),。 
  • 覆膜5
  • 使用說明書:1

 

自備物品 

1.   酶標儀(建議參考儀器使用說明提前預熱) 

2.   微量加液器及吸頭,EP

3.   蒸餾水或去離子水,,全新濾紙 

 

標本的采集及保存 

  • 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,,取上清即可檢測,,或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復凍融,。
  • 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,或將標本放于-20℃或-80℃保存,,但應(yīng)避免反復凍融,。
  • 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,,或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,,但應(yīng)避免反復凍融。

注:以上標本置4℃保存應(yīng)小于1周,,-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,,-20℃不應(yīng)超過1個月,-80℃不應(yīng)超過2個月,;標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

樣本處理:血清或血漿標本推薦稀釋100倍,,如:稀釋100倍,,取10uL血清或血漿加入990uLPBS。標本使用0.1 M 的PBS稀釋(PH=7.0-7.2),。

 

操作步驟

實驗開始前,,各試劑均應(yīng)平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解);試劑或樣品稀釋時,,均需混勻,,混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預測樣品含量,,如樣品濃度過高時,,應(yīng)對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,,計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

  • 加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應(yīng)120分鐘,。為保證實驗結(jié)果有效性,,每次實驗請使用新的標準品溶液。
  • 棄去液體,,甩干,,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl(在使用前一小時內(nèi)配制),,酶標板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘,。
  • 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,,甩干,,洗板3次,,每次浸泡1-2分鐘,,大約400μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干),。 
  • 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100μl,,酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。
  • 溫育60分鐘后,,棄去孔內(nèi)液體,,甩干,洗板5次,,每次浸泡1-2分鐘,,350μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干),。
  • 依序每孔加底物溶液90μl,,酶標板加上覆膜37避光顯色30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,,后3-4孔梯度不明顯,,即可終止)。
  • 依序每孔加終止溶液50μl,,終止反應(yīng),,此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準確性,,底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
  • 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值),。 在加終止液后立即進行檢測,。

 

1.  試劑準備:所有試劑都必須在使用前達到室溫,,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭,,避免交叉污染,。

2.   加樣:加樣或加試劑時,請注意在吸取標本 / 標準品,,酶結(jié)合物或底物時,,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的 “預孵育時間,,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)控制在10分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,,推薦使用多道移液器加樣,。

3.   孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),,酶標板加上蓋或覆膜,,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,,任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。

4.   洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,,同時要消除板底殘留的液體和手指印,,避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。

5.  試劑配制:Detection ADetection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆,。請配置標準品及工作液,,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10μl),,以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

6.  反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,,每隔10分鐘),如顏色較深,,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),,避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。

7.  底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

    建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,,以保證檢測結(jié)果的準確性。

    如標本中待測物質(zhì)含量過高,,請先稀釋后再測定,,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

 

洗板方法

1.  手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),,浸泡1-2分鐘,,根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次,。

2.  自動洗板:如果有自動洗板機,,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

 

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人OxLDL,,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

 

計算

  以標準物的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標),OD值為橫坐標(對數(shù)坐標),,在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,,如curve expert 1.3,,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù),;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,,再乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實際濃度。 

 

檢測范圍:0.312 ng/ml - 20 ng/ml

 

zui低檢測限0.078 ng/mL

 

說明 

  • 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
  • 試劑盒保存:短期(1周以內(nèi))以標簽上的標示為準,,長期保存請將試劑全部保存于-20℃。
  • 濃洗滌液會有鹽析出,,稀釋時可在水浴中加溫助溶,。 
  • 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),,此為正常現(xiàn)象,,不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。 
  • 所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
  • 有效期:6個月,。

 

 

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