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人氧化低密度脂蛋白(OxLDL)ELISA試劑盒說明書
本試劑盒僅供體外研究使用!
預期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中氧化低密度脂蛋白(OxLDL)含量,。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,,往包被抗OxLDL抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗OxLDL抗體、HRP標記的親和素,,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的OxLDL呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),,計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
自備物品
1. 酶標儀(建議參考儀器使用說明提前預熱)
2. 微量加液器及吸頭,EP管
3. 蒸餾水或去離子水,,全新濾紙
標本的采集及保存
注:以上標本置4℃保存應(yīng)小于1周,,-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,,-20℃不應(yīng)超過1個月,-80℃不應(yīng)超過2個月,;標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
樣本處理:血清或血漿標本推薦稀釋100倍,,如:稀釋100倍,,取10uL血清或血漿加入990uLPBS。標本使用0.1 M 的PBS稀釋(PH=7.0-7.2),。
操作步驟
實驗開始前,,各試劑均應(yīng)平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解);試劑或樣品稀釋時,,均需混勻,,混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預測樣品含量,,如樣品濃度過高時,,應(yīng)對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,,計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
注:
1. 試劑準備:所有試劑都必須在使用前達到室溫,,使用后請立即按照說明書要求保存試劑。 實驗操作中請使用一次性的吸頭,,避免交叉污染,。
2. 加樣:加樣或加試劑時,請注意在吸取標本 / 標準品,,酶結(jié)合物或底物時,,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的 “預孵育”時間,,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)控制在10分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,,推薦使用多道移液器加樣,。
3. 孵育:為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),,酶標板加上蓋或覆膜,,以避免液體蒸發(fā);洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,,任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。
4. 洗滌:洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,,同時要消除板底殘留的液體和手指印,,避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。
5. 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,,并使用相應(yīng)的稀釋液配制,不能混淆,。請配置標準品及工作液,,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,一次不要小于10μl),,以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
6. 反應(yīng)時間的控制:加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如,,每隔10分鐘),如顏色較深,,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),,避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。
7. 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,,以保證檢測結(jié)果的準確性。
如標本中待測物質(zhì)含量過高,,請先稀釋后再測定,,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
洗板方法
1. 手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),,浸泡1-2分鐘,,根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次,。
2. 自動洗板:如果有自動洗板機,,應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人OxLDL,,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
計算
以標準物的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標),OD值為橫坐標(對數(shù)坐標),,在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,,如curve expert 1.3,,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,再乘以稀釋倍數(shù),;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,,再乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實際濃度。
檢測范圍:0.312 ng/ml - 20 ng/ml
zui低檢測限:0.078 ng/mL
說明
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