魚促性腺激素釋放激素（GnRH）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預期應用

ELISA法定量測定魚血清,、血漿或其它相關液體中GnRH含量,。

概述

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中GnRH水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入GnRH,、生物素化的抗魚GnRH抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GnRH呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，其濃度為100 mIU/mL，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成100 mIU /mL,，50 mIU /mL ，25 mIU /mL,，12.5 mIU /mL,，6.25 mIU /mL，3.12 mIU /mL,，1.56 mIU /mL,，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋,。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標本的采集及保存

1．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存,，但應避免反復凍融,。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔。除空白孔外,，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul,，輕輕混勻，37℃,，120分鐘,。

2.         棄去液體，甩干,，不用洗滌,。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘,。洗板3次,，350ul/每孔，甩干,。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃，60分鐘,，洗板5次,，甩干,。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘,。

6.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次。
    自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的魚GnRH，且與其它相關蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

3．  請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。

4．  如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標準品、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆。

6．底物請避光保存,。

檢測范圍：

0.5 mIU /mL -400 mIU /mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響。

5．中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準。

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