大鼠骨鈣素（BGP）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究
使用目的：本試劑盒用于測定大鼠血清,，血漿及相

關(guān)液體樣本中骨鈣素（BGP）的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠骨鈣素（BGP）水平,。用純化的大鼠骨鈣素（BGP）抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入骨鈣素（BGP）,，再與 HRP標(biāo)記的骨鈣素（BGP）抗體結(jié)合，形成抗體 -抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物 TMB顯色,。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的骨鈣素（BGP）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在 450nm波長下測定吸光度（ OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠骨鈣素（BGP）濃度,。試劑盒組成：

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，其濃度為100 mIU/mL,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成100 mIU /mL，50 mIU /mL ,，25 mIU /mL,，12.5 mIU /mL，6.25 mIU /mL,，3.12 mIU /mL,，1.56 mIU /mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

樣本處理及要求：

1.血清：室溫血液自然凝固 10-20分鐘，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。

2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合 10-20分鐘后，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。

3.尿液：用無菌管收集，離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。

4.細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集,。離心 20分鐘左右（ 2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞

濃度達(dá)到 100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。

5.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心 20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。

6.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于 -20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融 .

7. 不能檢測含 NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（ HRP）活性,。

操作步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10孔,，在*、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品 100μl,，然后在*,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混勻,；然后從*孔,、第二孔中各取 100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl棄掉,，再各取 50μl分別加到第五,、第六孔中，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各取 50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl加到第九、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl,，混勻后從第九第十孔中各取 50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl,，濃度分別為 900ng/L,，600ng/L，300ng/L,，150ng/L,， 75ng/L）。

2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）,、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl,，然后再加待測樣品 10μl（樣品zui終稀釋度為 5倍）,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。

3.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 3 0分鐘。

4.配液：將 30（48T的 20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30（48T的 20倍）倍稀釋后備用,。

5.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置 30秒后棄去,，如此重復(fù) 5次,，拍干。

6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl,，空白孔除外,。

7.溫育：操作同 3。

8.洗滌：操作同 5,。

9.顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl,，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻,， 37℃避光顯色15分鐘.

10.終止：每孔加終止液 50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.測定：以空白空調(diào)零,， 450nm波長依序測量各孔的吸光度（ OD值）,。測定應(yīng)在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意事項(xiàng)：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。

3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時(shí)間控制在 5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4．請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的 OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n倍）后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存,。

7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) .

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9．本試劑不同批號組分不得混用,。 10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn),。

計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),， OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的 OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.  樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R值為 0.990以上。

2.  批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于 9%和 11%

檢測范圍：

50ng/L -1000ng/L

保存條件及有效期：

1   2-8℃,。

2   6個(gè)月

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