兔C反應(yīng)蛋白（CRP）ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定兔血清,、血漿、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中CRP含量,。

概述

C-反應(yīng)蛋白（CRP,，C-Reactive Protein）是一種由肝臟生成出來的特殊蛋白，因為對肺炎球菌的C 多糖體會有反應(yīng),，所以叫做C 反應(yīng)蛋白,。C-活性蛋白（CRP）是炎癥和感染等癥狀的一個臨床標(biāo)記,，但它也與受損的細胞結(jié)合，激發(fā)其補體（即參與免疫反應(yīng)的血清蛋白復(fù)合物）,。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中CRP水平,。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入CRP抗原,、生物素化的抗兔CRP抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的CRP呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為5000 ng/mL，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成2500 ng/mL,，1250 ng/mL ，625 ng/mL,，312.5 ng/mL,，156 ng/mL，78 ng/mL,，39 ng/mL,，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標(biāo)本的采集及保存

1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫,。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,。除空白孔外,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，輕輕混勻,，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘,。

2.         棄去液體,，甩干，不用洗滌,。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul,，37℃,60分鐘。洗板3次,，350ul/每孔,，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃,，60分鐘,，洗板5次，甩干,。

5.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。

6.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
    自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的兔CRP,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

3．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。

4．  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

39 ng/mL -5000 ng/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

4．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。

5．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

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