ELISA法檢測肺炎衣原體

    肺炎衣原體感染廣泛存在于*,，以隱性感染為主。其臨床表現(xiàn)多樣,，主要引起人非典型肺炎,，還可引起咽炎、支氣管炎,、虹膜炎,、肝炎、心內(nèi)膜炎及結(jié)節(jié)性紅斑等,，亦是艾滋病,、白血病等疾病繼發(fā)感染的重要病原，且與冠心病的發(fā)生相關(guān),，嚴(yán)重威脅人類健康,。常見檢查方法為ELISA法檢測肺炎衣原體抗體。

    [檢測方法]  ELISA法

    [方法學(xué)原理]  采用ELISA法,，血清加到包被純化的肺炎衣原體抗原的微滴孔中,，使之發(fā)生反應(yīng)，然后去除未結(jié)合的抗體,，加入結(jié)合有HRP的抗人Ig抗體使之與已結(jié)合的抗體反應(yīng),，結(jié)合的HRP與發(fā)色底物發(fā)生顏色反應(yīng)。zui后,，終止底物反應(yīng),，在酶標(biāo)儀上讀出光密度值。

    [標(biāo)本準(zhǔn)備]  取新鮮末梢血或靜脈血,。如采血后24h內(nèi)不能進(jìn)行試驗,，分離血清后將其保存于一20℃環(huán)境中。檢測時,，使樣本恢復(fù)至室溫,。

    [試劑]

    1．預(yù)包被微孔板

    2．陽性對照

    3．弱陽性對照

    4。陰性對照

    5．標(biāo)本稀釋液

    6,，濃縮酶聯(lián)物

    7,，底物A、B

    8．終止液

    [儀器]  酶標(biāo)儀或全自動酶聯(lián)免疫檢測儀,。

    [檢測步驟]

    1．配制洗滌液  l瓶濃縮洗滌液加475ml蒸餾水,。配好的洗滌液短期內(nèi)可置室溫環(huán)境中，長期可存于2—8℃環(huán)境中,。

    2．配制酶聯(lián)物  按1：101倍稀釋,，即取1u1濃縮酶聯(lián)物加酶聯(lián)物稀釋液1 000ul（根據(jù)檢測標(biāo)本數(shù)量確定稀釋量）,，未用完的丟棄。

    3．待試劑盒平衡至室溫后,，待測標(biāo)本按1,；51稀釋，即取4tA血清與200u1標(biāo)本稀釋液混合,。

    4．將稀釋標(biāo)本置37℃環(huán)境中20min,。

    5。各加100ul陽性,、弱陽性,、陰性對照及已稀釋待測標(biāo)本上清液于相應(yīng)孔中，空白對照孔加100u1標(biāo)本稀釋液,，蓋好反應(yīng)板,，置37℃環(huán)境中30min。

    6,。甩盡板中液體,，每孔用200～300ul洗滌液洗5次，每次均需拍干,。

    7．每孔加酶聯(lián)物100~1,，蓋好反應(yīng)板，置37℃環(huán)境中30min,。

    8．甩盡板中液體,，洗5次，每次拍干,。

    9．加底物A,、B各1滴或各50tzl，混勻,，置37℃環(huán)境中15min,。

    10．取出，加終止液1滴,，用酶標(biāo)儀450nm測其OD值,。若肉眼觀察則不加終止液，直接判斷結(jié)果,。

    [結(jié)果判斷）

    1．陰性對照平均OD值須小于0．20,。

    2．弱陽性對照平均OD值須在0．20—0．65。

    3．弱陽性對照與陰性對照的平均OD值之比須≥2,。符合以上3個條件時,，本試驗結(jié)果可信，否則重復(fù)實驗。

    4．若待測標(biāo)本孔顯色比弱陽性對照孔深則判為陽性,，反之為陰性,。但在弱陽性對照值上下10％范圍內(nèi)再測1次，如確實高于弱陽性對照則可判為陽性,。

    [正常參考值]  肺炎衣原體抗體陰性

    [注意事項]   

    1．本實驗結(jié)果須結(jié)合臨床表現(xiàn),、病史作出診斷后，方可采取適當(dāng)臨床處理,。

    2。試劑盒雖然含有消除干擾因子的物質(zhì),，但仍可能有少量標(biāo)本難以除盡干擾,。因此，如某標(biāo)本多項IgM均為陽性,，應(yīng)考慮RF的干擾,。

    [臨床意義]  肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體主要引起呼吸系統(tǒng)感染,。肺炎衣原體抗體的檢測主要用于肺炎衣原體肺炎的輔助診斷和肺炎衣原體感染的流行病學(xué)調(diào)查,。肺炎衣原體抗體在健康成人中的陽性率約25％～50％，而兒童陽性率低于成人,。

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