人脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PL-A2）試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中Lp-PL-A2含量,。

實驗原理

用純化的Lp-PL-A2抗體包被微孔板,，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的Lp-PL-A2抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Lp-PL-A2呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ 值）,，計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1,、 酶標板：一塊（96孔）

2,、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為6,000 pg/ml,，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成6,000 pg/ml,，3,000 pg/ml,，1,500 pg/ml，750 pg/ml,，375 pg/ml,，187.5 pg/ml，93.75 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml,。如配制3,000 pg/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）6,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

3、 樣品稀釋液：1×20ml,。

4,、 檢測稀釋液A：1×10ml。

5,、 檢測稀釋液B：1×10ml,。

6,、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A）,，充分混勻,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔），實際配制時應多配制  0.1-0.2ml,。

7,、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶,。

9,、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10,、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H₂SO₄）。

11,、覆膜：5張

12,、使用說明書：1份

自備物品

1、 酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）

2,、 微量加液器及吸頭,，EP管

3、 蒸餾水或去離子水,，濾紙

標本的采集及保存

1,、 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/font>-20 或-80 保存,，但應避免反復凍融。

2,、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨?/span>置于-20 或-80 保存,，但應避免反復凍融。

3,、 其它生物標本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/font>-20 或-80 保    存,，但應避免反復凍融,。

4,、 樣本處理：血清或血漿標本推薦稀釋100倍，如：稀釋100倍,，取10uL血清或血漿加入990uL樣品稀釋液,。標本使用0.02 M 的PBS稀釋（ PH=7.0-7.2）,。

注：以上標本均應密封保存,，4 保存應小于1周，-20 不應超過1個月,，-80 不應超過2個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

操作步驟

實驗開始前,，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解,；試劑或樣品配制時,，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應預測樣品含量,，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。

1,、 加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ,，注意不要有氣泡,，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時,。為保證實驗結(jié)果有效

性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2,、 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制）,，酶標板加上覆膜,，37 溫育1小時。

3,、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

4,、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜,，37 溫育1小時,。

5、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，方法同步驟3,。

6,、 每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控制在15-30分鐘,，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）,。

7,、 每孔加終止溶液50 ，終止反應,，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物    液的加入順序相同。

8,、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（ 值）,。

注：

1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2,、 加樣：加樣或加試劑時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預溫育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復孔進行實驗,。

3,、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應盡快進行下步操作,，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài),；同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

4,、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。

5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆,。請配制標準品及工作液,，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ）,，以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差,；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液,。

6、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。

7,、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

洗板方法

1,、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次。

2,、 自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人Lp-PL-A2,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應,。

計算

  各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點圖），如設(shè)置復孔,，則 應取其平均值計算,。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）， 值為橫坐標（對數(shù)坐標）,，在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3,，根據(jù)樣品 值,，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

檢測范圍：93.75 pg/ml - 6,000 pg/ml,，繪制標準曲線請取用以下濃度值：6,000 pg/ml,，3,000 pg/ml，1,500 pg/ml,，750 pg/ml,，375 pg/ml，187.5 pg/ml，93.75 pg/ml,。

zui低檢測限：23.4 pg/ml

說明

1,、  由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，

    本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險,。

2,、  zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),，請務必

準備充足的標本備份,。

3、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的   污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

4,、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品,、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ，其余試劑短期保存請置于4 ,，長期保存則置于-20 ,。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20 ,，避免潮濕,。

5、 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

6、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

7,、 有效期：6個月。

8,、 本操作說明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半。