葡萄球菌A蛋白（SPA）各種免疫檢測試劑的制備

    SPA試劑的種類很多，主要有SPA菌體，包括熒光菌體和各種抗體標(biāo)記的菌體；SPA純品標(biāo)記的熒光素、同位素和酶標(biāo)記試劑,；用于親和層析的SPA-Sepharose CL-4B、6MB和SPA—agarose，以及用于免疫電鏡觀察的SPA-鐵蛋白,、膠體金和SPA標(biāo)記的血藍(lán)蛋白等,。下面分別介紹幾種常用的SPA標(biāo)記試劑的制備方法。

    （一）SPA純品的制備

    目前市場上已有SPA純品出售（美國Sigma,、國內(nèi)上海生物制品研究所均有SPA純品出售）,，本書僅作了解性介紹。SPA純品系由含A蛋白的Cowan I株金黃色葡萄球菌中純化獲得,。其制備過程除細(xì)菌培養(yǎng)外,，主要有提取和純化這兩個工藝組成。提取方法多種,，其中溶葡萄球菌素與親和色譜組合方法zui有效?，F(xiàn)介紹如下。

    （1）用0．05mol／L（pH 7．5）的Tris—HCl洗下菌苔,，每100g濕菌加溶葡萄球菌素5mg,，調(diào)節(jié)pH值到3．5，離心后取上清,，并將pH值調(diào)到7．0,。

    （2）用飽和硫酸銨沉淀，溶解透析,，透析物用DEAE-SephadexA50純化,，以0．1mol／L碳酸氫銨（NH4HC03）平衡后上樣，再平衡過夜,。

    （3）用0．4mol／LNH‘HCOa洗脫（流速1．5ml／min）,，樣品測定AzTsam和活性，將含活性者合并,、濃縮、凍干保存于一40~C中,。

    （4）上述純化獲得的SPA可進(jìn)一步用IgG-Sepharose 4B親和層析柱過濾,，進(jìn)一步純化SPA。

    （5）純度鑒定  用7．5％聚丙烯酰胺凝膠為分離系統(tǒng)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,，樣品濃度為lmg／m1,，加樣量為40／／l。電泳結(jié)果應(yīng)顯示一條明顯條帶,。

    （二）熒光A蛋白純品的制備

    熒光A蛋白純品是在弱堿性條件下,，由熒光素通過蛋白上的氨基共價(jià)包繞于A蛋白純品制成。其制備如下,。

    （1）取一定量的A蛋白純品,，用內(nèi)含0．05mol／L NaCl的0．1mol／L氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到9．0。

    （2）于23~C暗處條件下，按lmol的A蛋白中加入2．8mol的FITC,，攪拌60min,，隨時用含0．15mol／L氯化鈉的0．1mol／L氫氧化鈉使pH值維持在9．0～9．5之間。

    （3）然后將標(biāo)記SPA用平衡鹽溶液于4℃透析數(shù)次,，過SephadexG-25柱,，除去未標(biāo)記的FITC，并調(diào)節(jié)濃度到lmg／ml,，裝入棕色瓶,，并保存于一20~C冰箱中。

    （三）酶標(biāo)記A蛋白純品的制備

    HRP可以于共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵方式黏附在其他的蛋白質(zhì)分子上,，常見的標(biāo)記方法有戊二醛一步法和二步法,，也可以用過碘酸鈉氧化法，它們主要為共價(jià)鍵結(jié)合方式,；另一種為非共價(jià)鍵結(jié)合方式,，是用4，4’—二氟—3,，3,，—二硝基苯基砜（4，4／—difluoro-3,，3,，—initrophenyl sul—lone，FNPS）作為交聯(lián)試劑,。戊二醛二步法的標(biāo)記效率要高于一步法,，過碘酸鈉氧化法的標(biāo)記效率要高于戊二醛二步法。其主要原理是二種蛋白質(zhì)分子的賴氨酸上的基團(tuán)和含氨基的N端經(jīng)活化劑活化而結(jié)合,。由于抗體和酶分子上所具有的反應(yīng)基團(tuán)很少,，需通過功能基團(tuán)（如戊二醛）將更多的抗體和酶分子結(jié)合在一起，酶分子首先和雙功能試劑結(jié)合,，再與抗體分子結(jié)合,，這樣可以結(jié)合更多的酶和抗體，而且無聚合物產(chǎn)生,。HRP還可以與生物素和親和素結(jié)合,。操作步驟如下。

    （1）取HRP 5mg,，溶于0．1ml新鮮配制的0．3mol／L（pH3．1） NaHC03中,，加0．1ml1％二硝基氟苯—無水乙醇，于室溫中避光輕輕攪拌1h,。

    （2）再加入0．08mol／LNalOa lml,，室溫中攪拌30min,。

    （3）再加0．08mol／L乙二醇lml，混勻后輕輕攪拌1h,。

    （4）裝入透析袋中,，在4℃條件下，用0．01mol／L（pH9．5）

    （4）裝入透析袋中,，在4℃條件下,，用0．01mol／L（pH9．5）碳酸鹽緩沖溶液1500ml于2000ml燒杯中透析。

    （5）稱取純晶SPA 5mg,，加入上述經(jīng)醛化的HRP中,，在25℃下充分混勻，輕輕攪拌5h,。

    （6）加5mgNaBH4,，置于4℃3h。

    （7）結(jié)合物用0．02mol／L,，（pH7．4）PBS4℃透析3～4次,，加等量甘油，-40℃或凍干避光保存,。

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