可能影響酶免疫測定ELISA結(jié)果的標本內(nèi)源性干擾因素

    內(nèi)源性干擾因素一般包括類風濕因子,、補體,、高濃度的非特異免疫球蛋白、異嗜性抗體,、某些自身抗體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)等,。在日常的臨床血清（漿）標本中，有相當比例不同程度的含有上述各種干擾物質(zhì),，從而導致測定結(jié)果的假陽性,。

    1．類風濕因子（rheumatoid factors，RF）  在類風濕患者,、其他疾病以及正常人血清中,，常含有較高或不同濃度的RF,，RF一般為IgM型，亦有IgG和IgA型,，RF具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點,，因為在ELISA測定中，其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標的特異抗體IgG結(jié)合,，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。尤其是在捕獲法IgM型特異抗體的測定中表現(xiàn)zui為明顯，因為此時固相包被的抗體為抗人弘鏈抗體,，IgM型RF的存在可使其大量結(jié)合于固相,。為避免RF對ELISA測定的干擾，通?？梢圆扇∠率龃胧?/span>

    （1）稀釋標本：這在判斷急性病原體感染的特異IgM抗體如抗HAVIgM,，抗HBclgM，TORCH的IgM抗體檢驗等尤為有用,。因為急性感染時,，血循環(huán)中特異的IgM抗體滴度通常很高，而RF滴度通常相對要低得多,。因此,，在測定前對標本進行稀釋，特異的IgM因高滴度存在仍可檢出,，而非特異的RF則會因為稀釋變成非常低的滴度,，從而對測定幾乎不產(chǎn)生干擾。現(xiàn)在,，有些特異IgM檢測ELISA試劑盒不要求稀釋標本,，直接檢測，這樣雖然方便了實驗室技術(shù)人員的操作,，但容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果,，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染,，血循環(huán)中抗HBelgM可持續(xù)以一定的滴度存在,，標本不做稀釋即進行檢測，即可出現(xiàn)陽性結(jié)果,，從而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的診斷價值,。因此，在臨床實驗室,， 一定要使用要求對標本做1∶1 000稀釋的試劑盒進行檢測,，從而保證相應(yīng)檢驗項目結(jié)果的可靠性及臨床應(yīng)用價值。

    （2）改變酶標抗體：由于RF結(jié)合的是IgG的F_c片段,，如果將待酶標的抗體的F,，片段酶切去除,，僅留下具有特異結(jié)合功能的F_（ab’）2部分標記酶，則在測定中即可避免RF的干擾,。

    （3）標本中RF用變性IgG預先封閉：將經(jīng)熱變性（63℃,，10 min）的動物如兔、羊等的IgG加入到標本稀釋液中,，或是將該變性IgG連接至一顆粒固相如聚苯乙烯微球或微孔,，然后加入臨床血清標本，反應(yīng)后,，再吸出標本進行檢測,。此外，在測定特異IgM時,，也可使用抗人IgG去除臨床標本中RF和IgG,。

    （4）測定抗原時，可在標本中加入可使RF降解的還原劑：如2—巰基乙醇,。2—巰基乙醇等還原劑可使抗體內(nèi)的巰基裂解,，因而可以去除RF的干擾，但只適用于抗原測定,。

    （5）包被或酶標二抗使用特異的雞抗體IgY：RF不與雞IgY反應(yīng),，如果包被和酶標二抗均為雞IgY抗體，則不受標本中RF的干擾,。

    2．補體  在固相酶免疫測定中,，來自哺乳動物的固相特異抗體和酶標二抗均有激活人補體系統(tǒng)的功能。一方面,，固相抗體和酶標二抗可因為其在固相吸附及結(jié)合過程中,，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，從而其F,，段的補體C1,，結(jié)合位點被暴露出來，這樣C1,，就成為一個中介物將二者交聯(lián)起來，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。另一方面,，固相抗體也會因為活化補體的結(jié)合，封閉抗體的抗原表位結(jié)合能力,，而引起假陰性結(jié)果或使定量測定結(jié)果偏低,。由補體引起的干擾可通過下述方法避免：

    （1）對臨床血清標本加熱滅活補體：采用56~C30 min加熱可使標本中的補體C1。滅活,。

    （2）包被或酶標二抗使用特異的雞抗體：雞抗體不激活人的補體系統(tǒng),，因此,，使用特異的雞抗體，不會出現(xiàn)因補體激活而存在的假陽性和假陰性干擾,。

    3．異嗜性抗體（heterophilieantibodies）  人類血清中含有抗嚙齒類動物（如鼠,、馬、羊等）

的免疫球蛋白（1g）的抗體,，即天然的異嗜性抗體,。有研究表明，天然的異嗜性抗體（1gG）可分為兩類,，一類（85％的假陽性由其引起）可結(jié)合于山羊,、小鼠、大鼠,、馬和牛IgG的Fab區(qū)域,，但不與兔IgG的Fab區(qū)結(jié)合。另一類（15％的假陽性由其引起）可結(jié)合于小鼠,、馬,、牛和兔IgG的Fc區(qū)表位，但不與山羊和大鼠IgG的Pc區(qū)表位結(jié)合,。異嗜性抗體可通過交聯(lián)固相和酶標的單抗或多抗而出現(xiàn)假陽性反應(yīng),。由異嗜性抗體引起的干擾可通過下述方法避免：

    （1）使用特異的兔F_（ab’）2。片段作為固相或測定酶標抗體,。

    （2）在標本或標本稀釋液中加入過量的動物Ig,，封閉可能存在的異嗜性抗體。但加入量不足或亞類不同時無效,。

    （3）使用靶特異的非Ig親和蛋白（affibody）替代固相或酶標抗體之一,。采用噬菌體展示技術(shù)展示來自單個金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）聯(lián)合文庫的人IgA結(jié)合親和蛋白，用于IgA的測定,，不受異嗜性抗體的影響,。

    （4）使用特異的雞抗體作為固相和測定抗體。

    4．因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體  在臨床上,，有嘗試使用鼠源性單克隆抗體進行靶向治療,，及使用放射性核素標記鼠源性單克隆抗體進行影像診斷等，均有可能使相應(yīng)患者體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體,。這種抗鼠抗體對使用鼠源性單克隆抗體的酶免疫測定,，可產(chǎn)生假陽性結(jié)果。由抗鼠抗體引起的干擾可通過下述方法避免：

    （1）使用特異的抗體F,，,。bf）：片段作為固相或測定酶標抗體。

    （2）在標本或標本稀釋液中加入過量的鼠Ig，封閉可能存在的抗鼠抗體,。

    （3）使用特異的雞抗體IgG作為固相和測定抗體,。雞IgG不與人抗鼠抗體反應(yīng)。因而,，用其作為固相或酶標抗體不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。

    5．自身抗體  自身抗體如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等,，能與其相應(yīng)靶抗原結(jié)合形成復合物,，在ELISA方法中可干擾相應(yīng)抗原抗體的測定。為避免以上情況出現(xiàn),，可在測定前用理化方法將其解離,。

    6．溶菌酶  溶菌酶可與等電點較低的蛋白有強的結(jié)合能力。免疫球蛋白等電點約為5,，因此,，在雙抗體夾心法ELISA測定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶標的IgG間形成橋接,，從而導致假陽性,。因此，為保證ELISA測定的可靠性,，有必要從標本中去除溶菌酶或?qū)⑵浞忾],，Cu²⁺離子和卵白蛋白可有效地封閉溶菌酶，防止其連接IgG,。

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