ELISA試劑盒酶標(biāo)記抗體的制備

    酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種,，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法,。

　?。?/span>1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過它而聯(lián)結(jié),。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記,。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種,。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中,，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。

ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián),。它具有操作簡(jiǎn)便,、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的,，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴(yán)格,，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶,，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián),，影響效果。在兩步法中,，先將酶與戊二醛作用,，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體,。也可先將抗體與戊二醛作用,，再與酶聯(lián)結(jié),。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度,，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低,。

    （2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標(biāo)記常用此法,。反應(yīng)時(shí),，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合,。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián)結(jié),，其*比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡(jiǎn)便有效,，一般認(rèn)為是HRPzui可取的標(biāo)記方法,，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演,。

按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體,。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中zui后的酶活性測(cè)定,，因經(jīng)過*洗滌,，游離酶可被除去，并不影響zui終的顯色,。但游離的抗體則不同,，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量,。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化,，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好,。純化的方法很多,，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法zui為簡(jiǎn)便,，但效果并不理想,，因?yàn)榇朔ㄖ荒苋コ粼谏锨逯械挠坞x酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開,。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，液相層析法可將制備的結(jié)合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶,、游離抗體和純結(jié)合物而取得*的分離效果,，但費(fèi)用較貴。

　　結(jié)合物制得后,，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過濃的結(jié)合物,，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高,；結(jié)合物的濃度過低,，則又影響檢測(cè)的敏感性。所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇,。zui適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí),，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的*靈敏度,，達(dá)到zui合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省,。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí),，能得到陽(yáng)性反應(yīng)的zui高稀釋度,。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后,，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí),，將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測(cè)中,，酶標(biāo)抗體的zui適工作濃度受到固相載體的性質(zhì),、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響,，因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的zui大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度,。

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