人羥脯氨酸（Hyp）ELISA試劑盒

使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!

預期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中Hyp含量,。

實驗原理

用純化的Hyp抗體包被微孔板，制成固相載體,，往微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的Hyp抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的Hyp呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1,、 酶標板：一塊（96孔）

2、 標準品（凍干品）： 2瓶,，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘,，同時反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為4,000 pmol/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）,，分別配制成4,000 pmol/ml,，2,000 pmol/ml，1,000 pmol/ml,，500 pmol/ml,，250 pmol/ml，125 pmol/ml,，62.5 pmol/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pmol/ml。如配制2,000 pmol/ml標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）4,000 pmol/ml的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

3,、 樣品稀釋液：1×20ml,。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml,。

5,、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A）,，充分混勻，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔）,，實際配制時應(yīng)多配制  0.1-0.2ml,。

7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。

8,、 底物溶液：1×10ml/瓶,。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H₂SO₄）,。

11,、覆膜：5張

12、使用說明書：1份

自備物品

1,、 酶標儀（建議儀器使用前提前預熱）

2,、 微量加液器及吸頭,，EP管

3、 蒸餾水或去離子水,，濾紙

標本的采集及保存

1,、 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4 過夜后于1000 g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/font>-20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復凍融。

2,、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于 1000 g離心15分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨?/span>置于-20 或-80 保存,，但應(yīng)避免反復凍融。

3,、 其它生物標本：請1000 g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/font>-20 或-80 保    存，但應(yīng)避免反復凍融,。

4,、 樣本處理：血清或血漿標本推薦稀釋10倍，如：稀釋10倍,，取100uL血清或血漿加入900uL樣品稀釋液,。標本使用0.1 M 的PBS稀釋（ PH=7.0-7.2）。

注：以上標本均應(yīng)密封保存,，4 保存應(yīng)小于1周,，-20 不應(yīng)超過1個月，-80 不應(yīng)超過2個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時,，均需充分混勻,，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預測樣品含量,，如樣品濃度過高時,，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

1、 加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?100 ,，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡,，加樣 時將樣品加于酶標板底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效

性,，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

2、 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標板加上覆膜,，37 溫育1小時,。

3、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘,，大約400 /每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4,、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ,，加上覆膜，37 溫育1小時,。

5,、 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，方法同步驟3。

6,、 每孔加底物溶液90 ,，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯時,，即可終止）。

7,、 每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng),，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物    液的加入順序相同。

8,、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（ 值）,。

注：

1、 試劑準備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2,、 加樣：加樣或加試劑時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預溫育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復孔進行實驗,。

3,、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi),，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài),；同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度,。

4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。

5,、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。請配制標準品及工作液,，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差,；請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液,。

6,、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘）,，如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

7,、 底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

洗板方法

1,、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次,。

2、 自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人Hyp，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計算

  各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點圖）,，如設(shè)置復孔，則 應(yīng)取其平均值計算,。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）,， 值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值,，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的 值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

檢測范圍： 62.5 pmol/ml - 4,000 pmol/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值：4,000 pmol/ml,，2,000 pmol/ml，1,000 pmol/ml,，500 pmol/ml,，250 pmol/ml,，125 pmol/ml，62.5 pmol/ml,。

zui低檢測限：15.6 pmol/ml

說明

1,、  由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，

    本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險,。

2,、  zui終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān),，請務(wù)必

準備充足的標本備份,。

3、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的   污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

4,、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品,、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20 ，其余試劑短期保存請置于4 ,，長期保存則置于-20 ,。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20 ，避免潮濕,。

5,、 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

6,、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

7,、 有效期：6個月,。

8、 本操作說明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半,。

詳情請登入: http://www.biohj.com/product.aspx?cid=1   http://www.biohj.com

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