基線：基線是早期循環(huán)的噪點水平,，通常在第3和第15循環(huán)之間測量，這是因為在此期間還檢測不到擴增產(chǎn)物引起的熒光值增加,。用于計算基線的循環(huán)數(shù)量是可以改變的,，如果使用高模板量或者靶標基因的表達水平高則循環(huán)數(shù)量需要減少。設置基線需要查看線性度擴增曲線的熒光數(shù)據(jù),。設置基線,，使得擴增曲線的增長所開始的循環(huán)圈數(shù)大于基線循環(huán)zui高圈數(shù)。對每個靶標序列都需要單獨設置基線,。早期循環(huán)檢測到的平均熒光值需要從擴增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去,。各種real-timePCR軟件的版本允許單個樣品自動優(yōu)化基線設置。
本底：是指反應中的非特異性熒光值,，例如,，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板,。信號的本底分量由real-time PCR軟件算法數(shù)學除去,。
報告基因信號 ：在real-time PCR過程中由SYBR Green或熒光標記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號。
歸一化報告信號(RN)：這是報告染料熒光強度除以在每個循環(huán)中測量的被動參照染料的熒光強度,。
被動參比染料 ：在某些real-time PCR中,，熒光染料ROX被用作熒光信號標準化內(nèi)部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準確,、孔位置及熒光波動造成的變動,。
閾值：閾值調(diào)整到本底值之上并顯著低于擴增曲線的平穩(wěn)值。它必須處于擴增曲線的線性區(qū)域內(nèi),，代表了PCR檢出的對數(shù)線性范圍,。閾值應在對數(shù)擴增曲線視圖中進行設置,，以使PCR的對數(shù)線性期易于識別。如果real-time PCR中有多個目標基因,，閾值必須為每個目標進行設定,。
循環(huán)閾值(CT)或交叉點(CP)：擴增曲線穿過閾值的循環(huán)(即，熒光檢測值顯著增加的點),。CT可以是一個分數(shù),，并且可以計算起始模板量。
ΔCT值： ΔCT值描述了靶標基因和相應的內(nèi)參基因CT值的差值,，例如看家基因,，并用于標準化模板的使用量：
ΔCT = CT (靶標基因) – CT (內(nèi)源性參比基因)
ΔΔCT值：ΔΔCT值描述了感興趣樣品(例如，刺激細胞)的平均ΔΔCT值與參考樣本(例如,，未刺激細胞)的平均ΔΔCT值之間的差值。參照樣品也被稱為校準樣品,，并且所有其它樣品進行相對定量時都將被標準化到如此：
ΔΔCT = 平均ΔCT (感興趣樣品) – 平均ΔCT (參比樣本)
內(nèi)源性參比基因：e這種基因的表達水平在樣品間不存在差異,，例如看家基因(3)。對比內(nèi)參基因與靶標基因的CT值可以將靶標基因的表達水平歸一化到輸入的RNA或cDNA的量(見上面關(guān)于ΔCT值部分),。反應中模板的確切數(shù)量不確定,。內(nèi)參基因?qū)σ韵虑闆r作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量,、逆轉(zhuǎn)錄效率,、核酸回收和樣品處理的變動。為了選出*的參照基因(多個),，我們對算法進行了改進,，允許其選擇依賴于實驗設置*參照(4)。
內(nèi)參：在同一反應中被作為靶序列擴增的,，并用不同的探針(即,，進行雙重PCR)檢測的對照序列。內(nèi)參經(jīng)常被用來排除失敗的擴增,，例如沒有檢測到目標序列的情況,。
標定樣品：在相對定量中使用的參比樣品(例如，源自細胞株或組織純化的RNA),，用以與所有其他樣品進行比較,，以確定某一基因的相對表達水平。標定樣品可以是任何樣品,，但通常是一個對照品(例如,，未處理的樣品或來自實驗零時的樣品)。
陽性對照：使用已知量模板的對照反應,。陽性對照通常用來檢查引物集或引物–探針集工作是否正常,，以及反應是否正確設置,。
無模板對照(NTC)：包含除模板之外的所有擴增反應所必要組分的對照反應。這使得發(fā)現(xiàn)由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能,，例如從以前的PCR中,。
無RT對照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測不被設計為僅檢測和擴增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進行檢測,。DNA污染可以通過操作在其中沒有加入逆轉(zhuǎn)錄酶的RT對照反應來進行檢測,。
標準品：已知濃度或拷貝數(shù)，用于構(gòu)建標準曲線的樣品,。
標準曲線：要生成標準曲線,，CT值/不同標準稀釋的交叉點對標準物質(zhì)輸入量的對數(shù)繪圖。標準曲線通常是使用至少5種不同濃度的標準稀釋倍比生成,。每個標準曲線,，應檢查其有效性，斜率值落在–3.3到–3.8之間,。標準是各濃度一式三份的理想測定值,。標準曲線的斜率如果與這些值差異較大則應該舍棄。
效率和斜率：標準曲線的斜率提供了對real-time PCR的效率指示,。斜率–3.322表示該PCR具有數(shù)值為1的效率,，或100%的效率，并且PCR產(chǎn)物的量在每個循環(huán)增加到兩倍,。效率小于–3.322(例如,，–3.8)則表示PCR的效率<1。通常,，大多數(shù)擴增反應因為實驗的限制不能達到100%的效率,。斜率大于–3.322(例如，–3.0)表明PCR效率似乎是大于100%的,。當在反應中的非線性期對值進行測量時可能發(fā)生這種情況,，或者它可以指示是否有抑制劑存在。
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