基線：基線是早期循環(huán)的噪點(diǎn)水平，通常在第3和第15循環(huán)之間測量,，這是因?yàn)樵诖似陂g還檢測不到擴(kuò)增產(chǎn)物引起的熒光值增加,。用于計(jì)算基線的循環(huán)數(shù)量是可以改變的，如果使用高模板量或者靶標(biāo)基因的表達(dá)水平高則循環(huán)數(shù)量需要減少,。設(shè)置基線需要查看線性度擴(kuò)增曲線的熒光數(shù)據(jù),。設(shè)置基線，使得擴(kuò)增曲線的增長所開始的循環(huán)圈數(shù)大于基線循環(huán)zui高圈數(shù),。對每個靶標(biāo)序列都需要單獨(dú)設(shè)置基線,。早期循環(huán)檢測到的平均熒光值需要從擴(kuò)增產(chǎn)物中獲得的熒光值中減去,。各種real-timePCR軟件的版本允許單個樣品自動優(yōu)化基線設(shè)置。
本底：是指反應(yīng)中的非特異性熒光值,，例如,，低效率的熒光淬滅，或由于使用SYBR Green造成的大量雙鏈DNA模板,。信號的本底分量由real-time PCR軟件算法數(shù)學(xué)除去,。
報(bào)告基因信號 ：在real-time PCR過程中由SYBR Green或熒光標(biāo)記的序列特異性探針產(chǎn)生的熒光信號。
歸一化報(bào)告信號(RN)：這是報(bào)告染料熒光強(qiáng)度除以在每個循環(huán)中測量的被動參照染料的熒光強(qiáng)度,。
被動參比染料 ：在某些real-time PCR中,，熒光染料ROX被用作熒光信號標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)部參照。它可以逐孔校正因校正因移液不準(zhǔn)確,、孔位置及熒光波動造成的變動,。
閾值：閾值調(diào)整到本底值之上并顯著低于擴(kuò)增曲線的平穩(wěn)值。它必須處于擴(kuò)增曲線的線性區(qū)域內(nèi),，代表了PCR檢出的對數(shù)線性范圍,。閾值應(yīng)在對數(shù)擴(kuò)增曲線視圖中進(jìn)行設(shè)置，以使PCR的對數(shù)線性期易于識別,。如果real-time PCR中有多個目標(biāo)基因,，閾值必須為每個目標(biāo)進(jìn)行設(shè)定。
循環(huán)閾值(CT)或交叉點(diǎn)(CP)：擴(kuò)增曲線穿過閾值的循環(huán)(即,，熒光檢測值顯著增加的點(diǎn)),。CT可以是一個分?jǐn)?shù)，并且可以計(jì)算起始模板量,。
ΔCT值： ΔCT值描述了靶標(biāo)基因和相應(yīng)的內(nèi)參基因CT值的差值,，例如看家基因，并用于標(biāo)準(zhǔn)化模板的使用量：
ΔCT = CT (靶標(biāo)基因) – CT (內(nèi)源性參比基因)
ΔΔCT值：ΔΔCT值描述了感興趣樣品(例如,，刺激細(xì)胞)的平均ΔΔCT值與參考樣本(例如,，未刺激細(xì)胞)的平均ΔΔCT值之間的差值。參照樣品也被稱為校準(zhǔn)樣品,，并且所有其它樣品進(jìn)行相對定量時都將被標(biāo)準(zhǔn)化到如此：
ΔΔCT = 平均ΔCT (感興趣樣品) – 平均ΔCT (參比樣本)
內(nèi)源性參比基因：e這種基因的表達(dá)水平在樣品間不存在差異,，例如看家基因(3)。對比內(nèi)參基因與靶標(biāo)基因的CT值可以將靶標(biāo)基因的表達(dá)水平歸一化到輸入的RNA或cDNA的量(見上面關(guān)于ΔCT值部分),。反應(yīng)中模板的確切數(shù)量不確定,。內(nèi)參基因?qū)σ韵虑闆r作出校正：可能的RNA降解或RNA樣品中存在酶抑制劑的情況，以及RNA含量,、逆轉(zhuǎn)錄效率,、核酸回收和樣品處理的變動。為了選出*的參照基因(多個)，我們對算法進(jìn)行了改進(jìn),，允許其選擇依賴于實(shí)驗(yàn)設(shè)置*參照(4),。
內(nèi)參：在同一反應(yīng)中被作為靶序列擴(kuò)增的，并用不同的探針(即,，進(jìn)行雙重PCR)檢測的對照序列,。內(nèi)參經(jīng)常被用來排除失敗的擴(kuò)增，例如沒有檢測到目標(biāo)序列的情況,。
標(biāo)定樣品：在相對定量中使用的參比樣品(例如,，源自細(xì)胞株或組織純化的RNA)，用以與所有其他樣品進(jìn)行比較,，以確定某一基因的相對表達(dá)水平,。標(biāo)定樣品可以是任何樣品，但通常是一個對照品(例如,，未處理的樣品或來自實(shí)驗(yàn)零時的樣品),。
陽性對照：使用已知量模板的對照反應(yīng)。陽性對照通常用來檢查引物集或引物–探針集工作是否正常,，以及反應(yīng)是否正確設(shè)置,。
無模板對照(NTC)：包含除模板之外的所有擴(kuò)增反應(yīng)所必要組分的對照反應(yīng)。這使得發(fā)現(xiàn)由于污染的試劑或外源DNA造成的污染成為可能,，例如從以前的PCR中,。
無RT對照： RNA制備物可能含有殘留的基因組DNA，如果檢測不被設(shè)計(jì)為僅檢測和擴(kuò)增RNA序列,其可以在real-time RT-PCR中進(jìn)行檢測,。DNA污染可以通過操作在其中沒有加入逆轉(zhuǎn)錄酶的RT對照反應(yīng)來進(jìn)行檢測,。
標(biāo)準(zhǔn)品：已知濃度或拷貝數(shù)，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品,。
標(biāo)準(zhǔn)曲線：要生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,，CT值/不同標(biāo)準(zhǔn)稀釋的交叉點(diǎn)對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)輸入量的對數(shù)繪圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線通常是使用至少5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋倍比生成,。每個標(biāo)準(zhǔn)曲線,，應(yīng)檢查其有效性,，斜率值落在–3.3到–3.8之間,。標(biāo)準(zhǔn)是各濃度一式三份的理想測定值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率如果與這些值差異較大則應(yīng)該舍棄,。
效率和斜率：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率提供了對real-time PCR的效率指示,。斜率–3.322表示該P(yáng)CR具有數(shù)值為1的效率，或100%的效率,，并且PCR產(chǎn)物的量在每個循環(huán)增加到兩倍,。效率小于–3.322(例如，–3.8)則表示PCR的效率<1,。通常,，大多數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)的限制不能達(dá)到100%的效率,。斜率大于–3.322(例如，–3.0)表明PCR效率似乎是大于100%的,。當(dāng)在反應(yīng)中的非線性期對值進(jìn)行測量時可能發(fā)生這種情況,，或者它可以指示是否有抑制劑存在。
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