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實(shí)驗(yàn)試劑
1. STE [0.1 mol/L NaCI,、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]
2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖,、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]
3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混勻)
4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8)
5. 異丙醇
6. 4 mol/L LiCI
7. RNase
8. 苯酚,、酚-氯仿、氯仿
9. 乙醇
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 搖床
2. 制冰機(jī)
3. 高速離心機(jī)
4. 水浴鍋
5. 超凈工作臺(tái)
6. 玻璃毛細(xì)管
7. 微量注射器
實(shí)驗(yàn)材料
棉花,，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 37℃, 250 rpm搖菌500 ml,。
2. 5000 × g離心5 min以收集菌體，用50 ml STE洗滌菌體一次,。
3. 加入溶液I 20 ml懸浮菌體,。
4. 加溶液II40 ml，輕輕將離心管顛倒幾次,，置冰浴20 min,。
5. 加預(yù)冷的溶液III30 ml，將離心管顛倒幾次,，置冰浴10 min以上,。
6. 10000 × g離心15 mm，取上清液加入0.6倍體積的的異丙醇,，充分混勻后室溫放置10 min以上。
7. 10000 × g離心10 min,，棄上清,。待沉淀干燥后用350ul水溶解，加350 ul 4 mol/L LiCI,，混勻后室溫放置10 min以上,。
8. 10000 × g離心5 min，取上清液加入RNase至終濃度為100 ug/ml,，37℃保溫2h,。
9. 用苯酚、酚-氯仿,、氯仿各抽提一次,。上清加0.1倍體積的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍體積的無水乙醇。
10. 離心收集DNA沉淀,，70%乙醇洗滌一次,。干燥后溶于TE中備用。
11. 棉花的遺傳轉(zhuǎn)化:大量的質(zhì)粒,，用無菌水稀釋成2 mg/ml的DNA溶液進(jìn)行子房注射,。注射在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，注射針是玻璃毛細(xì)管,，頂端直徑約為0.1mm,。將毛細(xì)管另一端緊緊套入10-20ul的微量注射器針頭，吸取被注射的DNA樣品6-12ul,。注射時(shí),，將針頭對(duì)準(zhǔn)子房伸出的花絲部分進(jìn)行,。每個(gè)子房約注射0.2ulDNA。