聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction,，PCR）技術(shù)是基因擴增技術(shù)的一次重大革新,，是分子生物學(xué)發(fā)展史中的一個重要里程碑。使用PCR擴增技術(shù),，可以將極微量的靶DNA片段特異地擴增上百萬倍,，大大提高了對DNA分子的分析和檢測能力。PCR技術(shù)具有敏感度高,、特異性強,、快速簡便等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué),、遺傳學(xué),、法醫(yī)學(xué)、微生物學(xué),、食品檢驗,、衛(wèi)生檢驗等眾多領(lǐng)域中具有巨大的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。
耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用是PCR技術(shù)的核心,。根據(jù)是否具有3’→5’端外切酶活性,，耐熱DNA聚合酶通常分為無校讀活性和有校讀活性兩類。無校讀活性的DNA聚合酶（以Taq 酶為代表）具有較高的擴增效率,，但由于缺乏校讀活性，容易發(fā)生堿基錯配,，故產(chǎn)物中點突變較多,。Taq DNA聚合酶還具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，可在PCR產(chǎn)物的3’末端非特異地添加堿基,，因單個A突出堿基的比例zui高,，故PCR產(chǎn)物可直接與含有3’末端突出T堿基的載體連接（即TA克隆）,，方便PCR產(chǎn)物的克隆,、擴增和測序。然而,，TaqDNA聚合酶在PCR反應(yīng)*步升溫過程中即可催化錯配引物延伸或引物二聚體形成,，因而導(dǎo)致非特異性擴增，影響目的片段的合成量,。針對這一現(xiàn)象設(shè)計的熱啟動Taq DNA聚合酶,，在低溫時其聚合酶活性被抑制，通過高溫變性,，聚合酶的活性恢復(fù),，催化特異性結(jié)合的引物擴增，因而提高了目的片段的特異性和產(chǎn)量,。另一類有校讀活性的DNA聚合酶（以Pfu為代表）可選擇性地去除錯誤摻入的dNTP,，維持DNA鏈的正確延伸,；然而其擴增效率通常低于Taq DNA聚合酶，特別是對于長片段DNA鏈的延伸能力較差,?；谏鲜鰞深惷傅奶攸c，可將適量的Taq DNA聚合酶與任意一種有校讀活性的DNA聚合酶混合,，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)緩沖液體系中,，可獲得保真性與擴增性能介于上述兩類酶之間的混合酶，用于長片段以及復(fù)雜模板的高保真擴增,。
PCR實驗受諸多因素的影響,。的商業(yè)化耐熱DNA聚合酶及其配套緩沖液通常可以滿足絕大多數(shù)DNA片段擴增的需要,。首先應(yīng)根據(jù)模板的性質(zhì)（基因組,、cDNA、質(zhì)粒等）和目的片段的大小,、GC含量,、有無二級結(jié)構(gòu)等，選擇合適的DNA聚合酶（參見GenStar? PCR產(chǎn)品選擇指南）,。對于難于擴增的片段,，應(yīng)針對不同的模板、引物,，優(yōu)化反應(yīng)條件,，以獲得*的擴增效率。
A. 模板用量：以50 μl反應(yīng)體系為例
? 人基因組DNA：0.1~1.0 μg
? 大腸桿菌基因組DNA：10~100 ng
? λ DNA：0.5~5 ng
? 質(zhì)粒DNA：0.1~10 ng
B. 引物設(shè)計原則：
? 引物長度要滿足特異性需要,，一般可在18~25個堿基之間,；擴增長片段時在24~30個堿基之間；
? （G+C）%含量應(yīng)盡量控制在40~60%,，兩條引物的（G+C）%含量應(yīng)盡量接近,；
? 盡量避免相同堿基連續(xù)出現(xiàn)三次以上，3’端應(yīng)避免使用A或T,；
? 避免引物內(nèi)部自身配對形成二級結(jié)構(gòu),；
? 正反向引物之間應(yīng)避免配對堿基，尤其是3’端的三個堿基,，否則易生成引物二聚體（Primer dimer）,；
? 兩條引物的Tm值應(yīng)盡量接近，相差不超過5oC,；
? 引物Tm值的計算方法：
20 nt以下：Tm = 2x（A + T）+ 4x（G+C）
20 nt以上：Tm = 81.5+0.41x（G+C%）-600/nt（nt：引物的堿基數(shù)）
C. 引物用量：
? 0.1~1.0 μM,，通常可以0.2 μM起始，根據(jù)體系不同調(diào)整用量,；
? 使用簡并引物,、隨機引物時，需增加引物總量以彌補產(chǎn)量損失,；但隨著引物量加大,，特異性將降低；
? 模板較大較多,，或結(jié)構(gòu)較復(fù)雜（如人基因組DNA）時,，需減少引物用量以提高特異性；
? 模板較小較少（如質(zhì)粒模板）時,，增加引物用量可提高產(chǎn)量,。
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