實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
（1）了解核酸瓊脂糖凝膠電泳的原理,，學(xué)會(huì)其具體的操作程序。
（2）對提取的DNA進(jìn)行檢測,，掌握紫外電泳圖譜的觀察分析方法,。
【實(shí)驗(yàn)原理】
瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速,、zui常用的分離純化和鑒定核酸的方法,。帶電荷的物質(zhì)在電場中的定向運(yùn)動(dòng)稱為電泳，核酸分子是兩性解離分子,，在pH8.0時(shí),，DNA分子帶負(fù)電荷在電場中向正極移動(dòng)。采用瓊脂糖凝膠介質(zhì)作為電泳支持物,，長度不同的DNA分子由于受凝膠阻遏作用大小不一,，遷移速度不同，從而達(dá)到有效分離DNA的目的,。
【儀器,、材料,、試劑】
（一）儀器
1．電泳裝置：電泳儀,、水平電泳槽、梳子,、制膠槽
2．紫外觀察：凝膠成像系統(tǒng)
3．高速離心機(jī)
（二）材料
1．瓊脂糖
2．三羥甲基氨基甲烷（Tris）
3．硼酸
4．乙二胺四乙酸（EDTA）
5．溴酚藍(lán)
6．蔗糖
7．溴化乙錠（EB）
8．DNA Marker（λDNA）
9．稱量紙,、容量瓶、瓷盤,、一次性手套,、取液器、三角瓶,、量筒（100mL）,、Tip頭（10uL）、膠帶
（三）試劑配制
1．5×TBE（pH8.0）（電泳緩沖液） 1000 ml
配制方法：
稱取Tris 54g,、硼酸 27.5 g,，再加入20ml的0.5mol/LEDTA加三蒸水定容至
1000ml搖勻后,，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽,，高壓滅菌后,，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
2．凝膠加樣緩沖液（6×）（指示劑） 100 ml
稱取溴酚藍(lán)0.25 g,、蔗糖40 g然后加入三蒸水定容至100ml搖勻后,，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
【實(shí)驗(yàn)步驟】
（一）、制膠
1．稱取0.4g（適量）瓊脂糖置于三角瓶中,，加入50ml 0.5×TBE緩沖液,。
2．微波爐加熱，煮沸,、振搖,，反復(fù)加熱、振搖2-3次,，使瓊脂糖充分融化,。
3．膠帶將膠床兩端粘好，底部粘嚴(yán),，以防凝膠滲漏,，插好梳子。
4．待膠冷卻至60℃左右時(shí),，將融化的瓊脂糖小心地倒入膠床中,，速度要快，讓 膠自然冷卻至*凝固（約需要20-30分鐘）,。
5． 小心向上方拔出梳子,，避免前后左右搖晃，以防破壞膠面及加樣孔,，去掉制膠槽兩邊的膠帶,，小心將膠和膠床放入電泳槽中，樣品孔在陰,。
6． 向電泳槽中加入0.5×TBE電泳緩沖液,，液面高于膠面約1-2mm。
（二）,、上樣電泳
1,、取2μl上樣液（溴酚藍(lán)指示劑）于Parafilm上，加2μl水與2μl樣品DNA反復(fù)吹吸,，混勻,。
2、Tip頭垂直伸入液面下膠孔中,，小心上樣于孔中,。
3,、接通電源，打開高壓開關(guān),，電泳開始以正,、負(fù)極鉑金絲有氣泡出現(xiàn)為準(zhǔn)。
4,、根據(jù)指示劑遷移的位置,，判斷是否中止電泳。切斷電源后,，再取出凝膠,。
5、凝膠取出后于含EB的溶液中染色20分鐘,。
（三）,、凝膠紫外觀察：
染色后的凝膠取出于紫外監(jiān)測儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察，照相,，保存,，記錄結(jié)果。
【注意事項(xiàng)】
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1. 瓊脂糖融化時(shí)，檔位不宜太高,。
2. 制膠和加樣過程中要防治氣泡的產(chǎn)生,。
3. EB具有強(qiáng)誘變性，可致癌,。必須戴手套操作,，嚴(yán)格注意防護(hù)。
4. 加樣時(shí),，Tip頭不宜插入樣品孔太深,，也不要穿破膠孔壁，否則樣品滲漏或
DNA帶型不整齊,。
5. 電源接通時(shí),，應(yīng)核實(shí)凝膠的方向是否正確,。
6. 電泳儀有電壓顯示,，并不一定標(biāo)志電泳槽已接通，應(yīng)觀察電極氣泡出現(xiàn)情況,。
負(fù)極的氣泡比正極多一倍,，表示電泳已開始。
7． 溴化乙錠可插入到DNA分子的雙鏈中,，在紫外光的照射下,，插入溴化乙錠的DNA呈橙紅色熒光,，所以溴化乙錠可以作為熒光指示劑指示DNA含量和位置。
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