1. 原理
戊二醛為一種雙功能試劑,，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合,，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物,。
2. 試劑及器材
（1）0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水（PBS）：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,，NaCl1.8克,，加蒸餾水至200ml,。
（2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS 1ml混合,。
（3）1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
（4）0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中,。
（5）0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水,。
（6）PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
（7）萘氏試劑及聚乙二醇（PEG,，MW2000）,。
（8）純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
（9）HRP（RZ>3.0）,。
（10）Sephadex G-25層析柱（2cm×50cm）,。
（11）攪拌器，分光光度計,，離心機,。
（12）透析袋，大,、小燒杯,，試管，吸管等
3. 標記步驟
（1）稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,，于室溫靜置過夜,。
（2）反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫,。流速控制在1ml/1分鐘,，收集棕色流出液,。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml,。放置25ml小燒杯中,，緩慢攪拌。
（3）將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,，攪拌下逐滴加入酶溶液中,。
（4）用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3小時,。
（5）加0.2M賴氨酸0.25ml,，混勻后，置室溫2小時,。
（6）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,，置4℃ 1小時。
（7）3000rpm離心半小時,，棄上清,。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中,。
（8）將上述溶液裝入透析袋中,，對0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測）,，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后,，冰凍保存,。
4. 結(jié)果判定
（1）定性及效價滴定：用特異性抗原（或抗體）同酶標記抗體（或抗免疫球蛋白抗體）作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,，可初步鑒定其活性,。zui后以直接ELISA法（或在正式實驗系統(tǒng)里）對酶結(jié)合物進行滴定（ 見本節(jié) （三）工作濃度的選擇）。
（2）定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定（光程1cm）,。
酶量（mg/ml）＝OD403nm×0.4
IgG量（mg/ml）＝（OD280nm-OD403nm×0.42）×0.94×0.62
（3）本法標記步驟比較簡單,，重復(fù)性好。缺點是酶的利用率低,，一般只有2-4%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合,。
