分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量,。
分光光度計(jì)的簡(jiǎn)單原理
分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源,，光源透過(guò)測(cè)試的樣品后,，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值,，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm,。 每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù),。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測(cè)試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液,。然而,，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問(wèn)題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上,，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度,。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的,。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高,，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了zui大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對(duì)較小,，結(jié)果穩(wěn)定。
從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低,，或者過(guò)高（超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍）,。zui后是操作因素，如混合要充分,，否則吸光值太低,，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡,，空白液無(wú)懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品,，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng),。
除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,，如 A 260 / A 280的比值,，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?280 nm,。純凈的樣品,，比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A 230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物，多肽,，苯酚等,，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A 320 一般是 0。
蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
這種方法是在280 nm波長(zhǎng),，直接測(cè)試蛋白,。選擇 Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。
蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單,，先測(cè)試空白液,，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320 nm的“背景”信息,，設(shè)定此功能“開(kāi)”。與測(cè)試核酸類似,，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A,，*的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí),，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,，只要觀察A 280的吸光值的變化范圍不超過(guò) 1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。
漂移的原因是因?yàn)?Warburg公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變,，濃度就會(huì)被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。
蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測(cè)試較純凈,、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),，速度快,，操作簡(jiǎn)單,；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA 的干擾,；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
比色方法一般有 BCA,，Bradford,，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以zui早期的 Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),，并有所改進(jìn),。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與 Biuret相比,，Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng),；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA,，Triton x-100,，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測(cè)試法,。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生 Cu+，后者與 BCA 形成螯合物,，形成紫色化合物,，吸收峰在 562 nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定,。相對(duì)于 Lowry 法，操作簡(jiǎn)單,，敏感度高,。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595 nm,。其zui大的特點(diǎn)是,，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 兩種測(cè)試方法的 2倍,；操作更簡(jiǎn)單,，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí),，方便結(jié)果；而且與一系列干擾 Lowry,，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT,，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的,。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,，無(wú)可比性。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致,，感到迷惑,，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一,，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性,。例如：Keller 等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果 Lowry,，BCA測(cè)出的濃度明顯高于Bradford,，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品,，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致,，測(cè)試后的濃度也不一致。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì),，以 BSA 作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,，濃度 2.64 mg /ml,。因此，在選擇比色法之前,，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成,，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品,。另外,，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大,。關(guān)鍵問(wèn)題是,，反應(yīng)后的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間,，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品）,，都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，得到的吸光值變小,，換算的濃度值降低。除此,，反應(yīng)溫度,、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外,，非常重要的是,，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色,，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。
細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期,，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度,。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度,。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法,。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液,。為了保證正確操作,，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線,。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值,，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后,，與培養(yǎng)基反應(yīng),，發(fā)生變色反應(yīng)。另外,，需要注意的是,，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài),。
