牛奶中蛋白質(zhì)的測(cè)定原理及其注意事項(xiàng)
摘要：本文主要針對(duì)應(yīng)用凱氏定氮法測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)的原理及其具體的消化和蒸餾過程中分別應(yīng)注意的幾大問題加以介紹，以期對(duì)從事蛋白質(zhì)測(cè)定工作的檢測(cè)人員有一定的幫助,。
關(guān)鍵詞：牛奶蛋白質(zhì) 測(cè)定原理 注意事項(xiàng)
蛋白質(zhì)對(duì)于人體具有構(gòu)成體內(nèi)原生質(zhì)和修補(bǔ)身體組織,，并制造酶和激素等生命基礎(chǔ)物質(zhì)，調(diào)節(jié)生理機(jī)能的作用,。蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物對(duì)食品的色,、香、味和產(chǎn)品質(zhì)量都有一定的影響,。蛋白質(zhì)的高低將直接決定食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,。牛奶作為人體*的蛋白質(zhì)供給源，屬于*蛋白質(zhì)，其中的8種人體必需氨基酸種類齊全,，比例適當(dāng),。其蛋白質(zhì)含量達(dá)牛乳的3.4%左右，乳蛋白的消化吸收率一般為97%-98%,，高于植物蛋白,，而且消化速度又比肉、魚,、蛋等動(dòng)物性蛋白快,。測(cè)定蛋白質(zhì)的方法很多，目前zui基本和zui常用的方法是先測(cè)定總氮量,，再乘以不同食品的蛋白質(zhì)系數(shù),，即為食品中蛋白質(zhì)的含量。測(cè)定總氮量的方法目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)仍采用凱氏定氮法為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法,。凱氏定氮法有常量法,、半微量法和微量法等。其測(cè)定原理相同,，主要區(qū)別在于常量法的樣品及試劑用量較微量法多,。而微量法則具有實(shí)驗(yàn)規(guī)模小，實(shí)
0 引 言
驗(yàn)費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn),。但微量法的準(zhǔn)確度和精密度比常量法要差一些,。另外，還有雙縮脲法,、紫外吸收光譜法,、福林-酚試劑法、考馬斯亮藍(lán)染色法等,，也常用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定,，由于方法簡(jiǎn)單快速，多用于生產(chǎn)單位質(zhì)量控制分析,。近年來國(guó)外還推出了近紅外品質(zhì)測(cè)試儀對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析的方法,。但凱氏定氮法正由于它的諸多優(yōu)點(diǎn)而仍然應(yīng)用普遍。
1．測(cè)定原理
將含有蛋白質(zhì)的待測(cè)樣品同濃硫酸一起加熱消化,，使氮變成氨,，同時(shí)形成氨鹽，在消化液中加入過量的堿,再加熱將氨蒸餾出來,并收集于硼酸溶液中,，zui后用酸堿滴定法測(cè)定其總氮量,。
1.1 消化
樣品中含氮有機(jī)物與濃硫酸和催化劑一起加熱消化.使蛋白質(zhì)分解,分解的胺基氨與過量的硫酸結(jié)合生成硫酸胺留在溶液中，其主要反應(yīng)式為：
RCH.NH2COOH+H2SO4 ->CO2+SO2+NH3+H2O
2NH3+H2SO4->（NH4）2SO4
另外,，催化劑硫酸銅在有機(jī)物全部消化后,，溶液顯清澈透明的藍(lán)綠色,，可用它來指示消化終點(diǎn)。此外,，硫酸銅還可用做下一步蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑,。 過氧化氫，為氧化劑,，有助于有機(jī)物消化,，同時(shí)可以消除消化過程中的氣泡現(xiàn)象。
1.2 蒸餾
消化終了后所有蛋白質(zhì)的氨態(tài)氮都轉(zhuǎn)化成銨鹽形式,，硫酸銨在堿性條件下進(jìn)行蒸餾,，將釋放出來的氨用硼酸溶液吸收，生成四硼酸氫銨．其反應(yīng)式：
?。∟H4）2SO4+2NaOH ->Na2SO4+2NH3+2H2O
NH3+4H3BO3 ->NH4HB4O7+5H2O
1.3 滴定
用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定產(chǎn)生的四硼酸氫銨,，根據(jù)消耗鹽酸溶液的量計(jì)算樣品含氮量，然后換算成蛋白質(zhì)含量,。
NH4HB4O7+HCL+5H2O ->NH4CL+4H3BO3
2.試劑與儀器
2.1 儀器及用具
凱氏燒瓶（500ml） 容量瓶（100ml）錐形瓶 酸式滴定管（25ml或50ml）
上海沛歐SKD-08S2消化爐 上海沛歐 SKD-100,200,600定氮儀（或定氮蒸餾裝置）
2.2試劑
試劑要求均為分析純,，所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制
濃硫酸 凱氏定氮催化劑過氧化氫溶液（體積分?jǐn)?shù)為30%）
NaOH溶液：（C（NaOH）=400g/L稱取400gNaOH固體，用100ml除去CO2的蒸餾水溶解,，待冷卻后移入試劑瓶?jī)?nèi)）
硼酸溶液：（C（H3BO3）為40g/L.稱取20g固體硼酸,，溶解于500ml熱蒸餾水中，搖勻備用）
甲基紅－溴甲酚綠混合指示劑：?。ㄓ皿w積分?jǐn)?shù)為95%乙醇,，將溴甲酚綠與甲基紅分別以2g/L溶于95%乙醇溶液中，使用時(shí)按5：1的比例混合）
鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：（C（HCL）=0.1000mol/L）
3. 操作過程的注意事項(xiàng)
3.1 消化
3.1.1凱氏定氮法的誤差,，主要因消化操作的條件而產(chǎn)生，因此要格外注意,。
4,。結(jié)束語
3.1.2量取的樣品倒入凱氏燒瓶時(shí)，不要將樣品粘在瓶頸上,，以免加入消化液后試樣炭化粘在瓶頸上消化不*．消化過程中要逐漸升溫,，當(dāng)?shù)蜏丶訙刂脸霈F(xiàn)帶有硫酸的白色氣體后，才可升溫使溶液沸騰,，但應(yīng)避免劇烈沸騰,。
3.1.3消化過程中，消化液體積不可蒸至少于原來的三分之二,，更不可蒸干,，若硫酸損失過多，應(yīng)酌量補(bǔ)加硫酸,。若取樣量較大,，如干待測(cè)樣超過5克，可按每克試樣5毫升的比例增加硫酸用量?！ ?/span>
3.1.4當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí),，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%雙氧水2-3毫升后再繼續(xù)加熱消化,。但在消化后期不得加入,，因此消化液中還原物質(zhì)（如：碳）含量減少，氧化劑易造成氨進(jìn)一步氧化為氮逸出,，使測(cè)定結(jié)果偏低,。
3.1.5消化液澄清后，必須繼續(xù)加熱沸騰三十分鐘,，以提高氮的回收率,，若催化劑中有硒存在，加熱時(shí)間過長(zhǎng)也可能使氮素?fù)p失,。一般情況下,，純牛奶需消化4.5小時(shí)即可。
3.2蒸餾
3.2.1．消化液加蒸餾水稀釋后,，應(yīng)及時(shí)蒸餾,，否則應(yīng)保存消化液，臨用時(shí)再加蒸餾水稀釋．反應(yīng)室加入堿液后,，應(yīng)立即蓋塞并加水封,，注意各接頭處的密封情況，防止漏氣,。
3.2.2 甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑必須于臨用前按比例混勻,，其在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色,，在酸性溶液中呈紅色,。
3.2.3．蒸餾時(shí)，加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外,，還與消化液中的硫酸和硫酸銅作用．反應(yīng)式：
2NaOH+H2SO4 ->Na2SO4+2H2O
2NaOH+CuSO4 ->Na2SO4+Cu（OH）2
Cu（OH）2 ->CuO +Cu（OH）2
若加入的氫氧化鈉不夠,，則溶液呈藍(lán)色，不生成褐色的氫氧化銅沉淀．所以,，加入的氫氧化鈉必須過量,，并且動(dòng)作還要迅速，以防止氨的流失,。
3.2.4．蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水裝至三分之二體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水中加入稀硫酸,，使之呈酸性，內(nèi)加甲基橙指示劑數(shù)滴,，水應(yīng)呈橙紅色,，如變黃時(shí),，應(yīng)該補(bǔ)加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出,，使結(jié)果偏大,。
3.2.5．因蒸餾時(shí)反應(yīng)至外層的氣壓大于反應(yīng)室內(nèi)的壓力，而反應(yīng)室的壓力大于大氣壓力,，故可將氨帶出,。所以，蒸餾時(shí),，蒸氣要發(fā)生均勻,，充足，蒸餾中不得?；饠鄽?，否則，會(huì)發(fā)生倒吸,。停止蒸餾時(shí),，由于反應(yīng)室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應(yīng)室外層,，所以,，操作時(shí)，應(yīng)先將冷凝管下端提高液面并清洗管口,，再蒸一分鐘后關(guān)掉熱源,。蒸餾是否*，可用精密ＰＨ試紙測(cè)冷凝管口的冷凝液來測(cè)定,，中性則說明已蒸餾*,。
3.2.6 在鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制時(shí)，必須將基準(zhǔn)無水碳酸鈉于270-300℃灼燒至恒重后稱取所須用量,，否則也會(huì)影響蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
牛乳提供了人體必需的蛋白質(zhì)，而提供準(zhǔn)確可靠的蛋白質(zhì)含量則是食品檢驗(yàn)工作人員的必需技術(shù),，凱氏定氮法作為目前法定的國(guó)標(biāo)方法與我們的工作密不可分,，本文主要通過綜述凱氏定氮法操作的注意事項(xiàng)而提供給關(guān)注此檢測(cè)方法的從業(yè)人員一定的幫助,，與筆者和讀者會(huì)有一定提高,。
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