超濾離心管使用方法和注意事項  

蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）,。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選,，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積,、濃縮目標體積而定?？芍貜褪褂谩? 

1,、選擇合適的超濾管,，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管,。  

2、新買來的超濾是干燥的,，使用前加入MilliQ水,，水量*過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘,。然后將水倒出,，即可加入蛋白液，加入的多少,，以不超過管頂?shù)陌拙€為準,。操作要輕，加入蛋白液前,，超濾管需要插在冰上預冷,。  

3、平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達到平衡,。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）,。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機的情況是膜與軸垂直）,。在實際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長離心管的使用壽命,。

  4、當濃縮到剩下1ml時,，【取50ul國產(chǎn)Bradford溶液,，加入10ul流穿，看有沒變藍色,，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾,。要判斷是否漏管,，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿,，跑蛋白膠或Bradford粗測】,，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱）,，直到所有濃縮液都加完為止,。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導致堵管,。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適,；前者可用多根超濾管同時超濾,，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止,。  

5、前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾）,，再濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次，zui后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況,。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上,，基本上可以達到換buffer的目的,。 

 6、取出zui終蛋白濃縮液的操作在冰上操作,，用黃槍頭（200ul）取,，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打,、混勻蛋白液,，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液,，每次吸接近200ul,，直到吸完。管底剩下的zui后一點濃縮液不必吸取,，否則難度太大,，有可能損壞超濾膜。zui后加入MilliQ水到超濾管中,，沒過超濾膜,，防止膜失水變干。