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西美杰代理KPL熒光標記二抗

一般來講，偶聯(lián)到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,，PAP）,，熒光基團（FITC, RRX, TR, PE, Rhodamine）和生物素,。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗，對于Western Blot和ELISA,，常用的二抗是酶標二抗,；而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學,，流式細胞術(shù)）中通常使用熒光標記的二抗,。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使Biotin/Avidin檢測系統(tǒng),。其中熒光素是具有光致熒光特性的染料,，熒光染料種類很多，目前常用于熒光標記二抗的主要有以下幾種：

• 異硫氰酸熒光素-Fluorescein Isothiocyanate (FITC)

FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水和酒精溶劑,。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm,，最大發(fā)射光波長為520～530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年,，是目前應用廣泛的熒光素,。由于FITC是小分子化合物，每一個抗體可標記幾個FITC分子,，IgM通常用小分子的熒光素標記,，如FITC、Cy3/5,、Texas Red等,。FITC熒光二抗主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色,。然而FITC的缺點是淬滅快,，因此要和抗淬滅劑一起使用。

• 四甲基異硫氰酸羅丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC),，Rhodamine Red-X(RRX), Texas Red(TR)

這些羅丹明的衍生物耦聯(lián)基團具有不同的吸收波長 (550, 570, 596nm)和最大發(fā)射波長（570, 590, 620nm）,。在使用裝有氪氬燈的激光共聚焦掃描顯微鏡作三標記的實驗時，RRX尤其有用,，可以和Cy2(或者FITC)和Cy5一起使用,，因為RRX的發(fā)射波長在Cy2和Cy5中間，而且和這兩者覆蓋都很少,，氪氬燈激發(fā)光為488nm,，598nm和647nm，分別是Cy2(FITC), RRX和Cy5的理想激發(fā)波長。因為FITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā), 在流式細胞儀中用FITC作雙標,，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團要比羅丹明好,。TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末,，較穩(wěn)定,，最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為620nm,，呈現(xiàn)橙紅色熒光,，與FITC的綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。因TRITC熒光淬滅慢,，也可用于單獨標記染色。

• 菁類染料-Cyanine dyes(Cy2, Cy3, Cy5)

Cy2耦聯(lián)基團激發(fā)波長為492nm,，發(fā)光波長為510nm的綠色可見光,。Cy2和FITC使用相同的濾波片。由于Cy2比FITC在光下更穩(wěn)定,，要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因為這種抗淬滅劑和Cy2反應,，在染色片儲存后會導致熒光微弱和擴散,。Cy3和Cy5比其他的熒光團探針要更亮，更穩(wěn)定,，背景更弱,。Cy3耦聯(lián)基團激發(fā)光和發(fā)射光波長很接近TRITC, 在熒光顯微鏡中，可使用和TRITC一樣的濾波片,。Cy3在氬光燈（514nm或528nm）下可以被激發(fā)出50％的光強,，在氦氖燈（543nm）或者汞燈（546nm）下則約75％。Cy3可以和熒光素一起作雙標,。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實驗中作多標記,。Cy5耦聯(lián)基團的激發(fā)波長最大650nm，發(fā)光波長最大670nm,。在氪氬燈（647nm）下它們可被激發(fā)出98％的熒光,，在氦氖燈下（633nm）為63％。Cy5可以和很多其他的熒光基團一起用在多標記的實驗中,。由于它的最大發(fā)射波長在670nm,，Cy5很難用裸眼觀察，而且不能用汞燈作理想的激發(fā),。通常觀察Cy5時采用具有合適激發(fā)光和遠紅外檢測器的共聚焦顯微鏡,，在水相封片劑中應當加入抗淬滅劑。使用傳統(tǒng)的表面熒光顯微鏡時，不推薦使用Cy5,。

注：由于觀察熒光需要一定波長的激發(fā)光,，必須根據(jù)實驗室已有的儀器可發(fā)光的波段進行選擇。另外注意多標記中對探針色彩區(qū)分程度的要求,，例如,，若丹明紅-X (RRX)和德克薩斯紅(TR)熒光素的區(qū)別就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的區(qū)別明顯。如果對靈敏度有更高的要求,，則Cy3和Cy5就比其他的熒光團探針要亮,。

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注：表格數(shù)字部分為產(chǎn)品貨號

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