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病毒載體技術(shù)的進(jìn)步提高了基因和細(xì)胞治療的安全性和有效性，全球已有多種基因和細(xì)胞治療藥物被監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)上市,。目前大多數(shù)基因/細(xì)胞治療方法都是利用病毒載體來實(shí)現(xiàn)的,，其中常用的兩種病毒載體——腺相關(guān)病毒（AAV）載體常被用于基因治療，而慢病毒（LV）載體則常被用于基因修飾的細(xì)胞治療,。病毒載體通常是將2-4個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞生產(chǎn)出的,，而轉(zhuǎn)染試劑是病毒載體生產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一，對(duì)轉(zhuǎn)染效率和功能效價(jià)有顯著影響,。第一代非病毒轉(zhuǎn)染方法依靠簡單的線性聚合物,，如聚乙烯亞胺(PEI)或脂質(zhì)體將DNA轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)，但其性能并不能*病毒載體的大規(guī)模生產(chǎn)需求,。雖然人工合成轉(zhuǎn)染試劑在過去30年里取得了巨大的進(jìn)步,，但仍然難以逾越大自然在數(shù)十億年進(jìn)化出的依靠病毒傳遞基因的效率。因此,，優(yōu)化非病毒轉(zhuǎn)染性能的最佳方法是盡可能模仿出病毒轉(zhuǎn)運(yùn)DNA的自然機(jī)制的試劑,。

TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染試劑

西美杰代理的Mirus轉(zhuǎn)染試劑就是利用自然基因傳遞機(jī)制作為其化合物庫的設(shè)計(jì)靈感，從中篩選出適合病毒生產(chǎn)的混合配方,，將轉(zhuǎn)染試劑與核酸的靜電相互作用,、細(xì)胞吸附與內(nèi)吞、胞內(nèi)釋放,、基因表達(dá)效率和降低細(xì)胞毒性等幾乎所有影響轉(zhuǎn)染成功率的因素全部考慮在內(nèi),。通過不懈的努力，Mirus開發(fā)出了一種全新的仿生轉(zhuǎn)染技術(shù)——TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染試劑,，它不僅僅是基于PEI或脂質(zhì)體,，而是采用多組分脂質(zhì)聚合物納米復(fù)合物（LPNC），能夠高效地結(jié)合和包裹DNA,，將其帶入懸浮或貼壁的HEK293細(xì)胞中,，然后將其從細(xì)胞核內(nèi)釋放，以便同時(shí)滿足2-4個(gè)不同的質(zhì)粒的表達(dá),，這種全新的轉(zhuǎn)染試劑比單獨(dú)使用PEI及其衍生聚合物或脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率和完整病毒生產(chǎn)效率都有顯著提高,。同時(shí),，Mirus還研發(fā)出了一種*合成的（無動(dòng)物源）轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑（Enhancer），與TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑搭配使用時(shí),，可以進(jìn)一步提高病毒滴度,。另外，為了滿足病毒載體從研發(fā)到大規(guī)模生產(chǎn)不同階段的需求,，Mirus分別推出了R&D,、SELECT和GMP三種級(jí)別的TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染系列產(chǎn)品，以適應(yīng)不同階段病毒載體的生產(chǎn)規(guī)模,、效率以及法規(guī)要求,。

實(shí)驗(yàn)表明，Mirus基于LPNC的轉(zhuǎn)染試劑可以在不同的細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)（貼壁和懸?。?/span>,、生物反應(yīng)器和培養(yǎng)基類型中提高病毒產(chǎn)量和功能性病毒滴度。與業(yè)內(nèi)其他金標(biāo)準(zhǔn)相比,，在不使用增強(qiáng)劑的情況下,，病毒滴度至少可提高2-4倍。而在加入增強(qiáng)劑之后,，在合適的培養(yǎng)條件下,，病毒產(chǎn)量甚至能夠提高10倍以上！（結(jié)果見下圖1-5）

圖1. 基于脂質(zhì)聚合物納米復(fù)合物（LPNC）和聚乙烯亞胺（PEI）配方的轉(zhuǎn)染試劑用于腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(LV)載體生產(chǎn)的性能對(duì)比,。分別用基于LNPC的TransIT-VirusGEN試劑（不含增強(qiáng)劑與含增強(qiáng)劑）,、25kda PEI和基于PEI技術(shù)的競爭品牌A3轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)生AAV（左）和LV（右）。以LPNC為基礎(chǔ)的TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑比以PEI為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染試劑的病毒顆粒表達(dá)量高3-5倍,。當(dāng)TransIT-VirusGEN和增強(qiáng)劑同時(shí)使用時(shí),，比單獨(dú)使用TransIT-VirusGEN大約提升了一倍。轉(zhuǎn)染試劑 : DNA的比值為體積 : 質(zhì)量,。

圖2. TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑在不同細(xì)胞培養(yǎng)基中的表現(xiàn),。使用Thermo Fisher Scientific公司的病毒生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，該細(xì)胞適應(yīng)四種不同的培養(yǎng)基配方,，分別來自Thermo Fisher公司的LV-MAX培養(yǎng)基,、Expi293表達(dá)培養(yǎng)基、FreeStyle F17表達(dá)培養(yǎng)基和來自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培養(yǎng)基,。后一種培養(yǎng)基的AAV總效價(jià)較高,，但在所有使用的培養(yǎng)基中，無論是否添加增強(qiáng)劑,，TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑均表現(xiàn)優(yōu)異,。DNA與轉(zhuǎn)染試劑配比為2μg DNA ：3μl轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度為2.0×106個(gè)/ml。生產(chǎn)LV也獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示),。

圖3. 分別在四種不同的轉(zhuǎn)染條件和兩個(gè)不同的收獲時(shí)間,，測定TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑和PEI為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染試劑A3的物理滴度和功能滴度。利用Expi293F細(xì)胞生產(chǎn)AAV2-GFP,。轉(zhuǎn)染48小時(shí)和72小時(shí)后收獲的病毒分別測定功能滴度TU/mL（左）和物理滴度GC/mL（右）,。結(jié)果顯示用TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑和增強(qiáng)劑轉(zhuǎn)染收獲的病毒效價(jià)最高。此外,，TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑比PEI為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)染試劑的表達(dá)更快,。這些結(jié)果表明，對(duì)于病毒滴度的評(píng)估,，功能滴度可能是一個(gè)更可靠的指標(biāo),。因此，建議測試幾個(gè)不同的收獲時(shí)間點(diǎn)來確定最佳方案,。

圖4. 每種培養(yǎng)體系都應(yīng)優(yōu)化轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞融合度和接種密度,。用DMSO+10%胎牛血清培養(yǎng)貼壁的HEK293t/17細(xì)胞生產(chǎn)慢病毒（1μg DNA/mL）。試劑盒包括TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑,、VirusGEN LV復(fù)合物形成溶液和VirusGEN LV增強(qiáng)劑。

圖5. 在Expi293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Expi293F細(xì)胞,，使用VirusGEN AAV轉(zhuǎn)染試劑盒,，內(nèi)含TransIT-VirusGEN轉(zhuǎn)染試劑、VirusGEN AAV復(fù)合物形成溶液和VirusGEN AAV增強(qiáng)劑,，在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中生產(chǎn)AAV,。分別用2:1（左）和3:1（右）兩種比例來確定理想的轉(zhuǎn)染試劑和DNA配比（體積：質(zhì)量）。每種轉(zhuǎn)染體系都應(yīng)對(duì)轉(zhuǎn)染試劑: DNA配比及每毫升細(xì)胞所需的總DNA量進(jìn)行優(yōu)化,。

TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染產(chǎn)品信息

TransIT-VirusGEN系列轉(zhuǎn)染試劑

美國Mirus公司成立于1995年,，是世界上很早開發(fā)高效、低毒轉(zhuǎn)染試劑的公司之一,，同時(shí)也是目前該類試劑主要的供應(yīng)商之一,。Mirus許多杰出成果獲得廣大用戶的好評(píng)。

北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區(qū)代理,，始終秉承著專業(yè),、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品與服務(wù)。如果您對(duì)上述產(chǎn)品感興趣,，歡迎聯(lián)系北京西美杰解更多產(chǎn)品信息或申請?jiān)囉?/span>,。北京西美杰是Mirus代理，Mirus中國代理,，Mirus北京代理,，Mirus總代理，Mirus上海代理，,，Mirus西北代理,，Mirus西南代理，Mirus東北代理,，Mirus華北代理,，Mirus華南代理，Mirus華中代理,，負(fù)責(zé)Mirus在中國的相關(guān)業(yè)務(wù),。

引用文獻(xiàn)：

Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.