1，用異硫氰酸胍提取
提禽流感病毒的詳細(xì)步驟,，可參考（我提過N次做定量PCR都沒問題）：
1.取200ul樣品數(shù)+陰性對(duì)照+陽性對(duì)照個(gè)1.5ml滅菌eppendorf管
2.加600ul異硫氰酸胍,，然后加入對(duì)照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻
3.13000rpm離心15min
4.在第3步離心快結(jié)束時(shí),，另取同樣多eppendorf管,，加入400ul -20度預(yù)冷的異丙醇
5.取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結(jié)束往外拿的時(shí)候,，管子盡量不要傾斜）轉(zhuǎn)移到第4步準(zhǔn)備的管中,，顛倒混勻
6.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清,；在吸水紙上盡量沾干液體
7.加600ul 75％乙醇,，顛倒數(shù)次以洗滌殘存異丙醇
7.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清,；在吸水紙上盡量沾干液體
8.4000rpm離心10sec,，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干,，室溫干燥2－3min（不可過分干燥,，防止下一步RNA不溶解）
9.加入20ul DEPE水（加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水），輕輕混勻溶解RNA,。2000rpm離心5sec,，冰上保存?zhèn)溆茫?小時(shí)內(nèi)使用，以免RNA降解）

2,，用TRIzol LS提取
應(yīng)用TRIzol LS提取病毒RNA
所提取物為血清,、血液、細(xì)胞培養(yǎng)液,、雞胚尿囊液等液體中的病毒,。提取時(shí)盡量在人少時(shí)進(jìn)行，防止空氣中RNA酶的污染,。所用一切物品也應(yīng)是無RNA酶的,。
1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul,，充分混勻,，室溫放置10min。
1.2 加入200ul的氯仿,，蓋緊離心管蓋,，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀,，無分相現(xiàn)象）,，室溫放置10min （由于氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā),，振蕩時(shí)離心管可能爆開,，小心）,。
1.3 離心 4℃、13000r/min,、15min,，取上層液相移入另一管（切忌吸動(dòng)白色中間相）。
1.4 加入等體積異丙醇,，輕輕顛倒離心管充分混勻液體,，室溫放置10min。
1.5 離心 4℃,、13000r/min,、15min，（這時(shí)乍一看會(huì)發(fā)現(xiàn)管子里好像沒有東西,，再仔細(xì)看看,，會(huì)發(fā)現(xiàn)靠近管底的壁上有一星點(diǎn)的白色沉淀物，就是它了）用槍小心吸去所有上清,。
1.6 1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃,、8000r/min,、10min，（這時(shí)又會(huì)發(fā)現(xiàn)管子沒東西了,，不要擔(dān)心,，有的，但是因?yàn)榱刻倏床灰娏T了）用槍小心吸去所有上清,，在超凈臺(tái)中干燥5min,。
1.7 加入適量DEPC處理水。（如果材料來源豐富的話,，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量,；若要省著點(diǎn)用，則自己看著辦了,，盡量不要加太多的水）,。
1.8 建議立即做RT。若要保存,，可在上一步加入乙醇后凍存于－70℃,，可保存一年；若加入DEPC水后則只能在－20℃保存1個(gè)月左右,。

3,，Trizol法提禽流感病毒protocol
Trizol法適用于人類、動(dòng)物,、植物,、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌,，樣品量從幾十毫克至幾克。
1,、 取雞胚尿囊液,，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻,；
2,、 室溫放置5分鐘，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,，蓋緊離心管,，用手劇烈搖蕩離心管15秒；
3,、 取上層水相于一新的離心管,，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘,，12000g離心10分鐘,；
4、 棄去上清液,，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,，混勻，4℃下7500g離心5分鐘,；
5,、 重復(fù)第4步,；
6,、 小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10分鐘,，注意不要干燥過分,，否則會(huì)降低RNA的溶解度,；
7、 然后將RNA溶于水中,，放置10分鐘,。

[注意]
1、 整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套,，并盡可能在低溫下操作,。
2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上,，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,，-20℃保存一年