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PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR),一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,,PCR的大特點(diǎn),,是能將微量的DNA大幅增加,。PCR的原理:PCR的基本過程類似于DNA的天然復(fù)制,特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的Oligo引物,。整個(gè)過程由變性-退火-延伸3個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成,。
PCR實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散的原因如下:
(1)酶量過高。減少酶量,;酶的質(zhì)量差,,調(diào)換另一來源的酶。
(2)dNTP濃度過高,。減少dNTP的濃度,。
(3)MgCl2濃度過高??蛇m當(dāng)降低其用量,。
(4)模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,,而基因組DNA則應(yīng)<200ng,。
(5)引物濃度不夠優(yōu)化。對(duì)引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng),。
(6)循環(huán)次數(shù)過多,;增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間,,或改用二種溫度的PCR循環(huán),。
(7)退火溫度過低。
(8)電泳體系有問題:
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大,;
②凝膠沒有凝固好,;
③瓊脂糖質(zhì)量差。
(9)若為PCR試劑盒則可能:
①由于運(yùn)輸儲(chǔ)存不當(dāng)引起試劑盒失效,;
②試劑盒本身質(zhì)量有問題,,如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng),。
(10)降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布,。
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