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PCR實驗出現(xiàn)凝膠涂布貨片狀條帶彌散的原因

時間:2023/6/13閱讀:4819
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PCR:聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR),一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術(shù),,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,,PCR的大特點,是能將微量的DNA大幅增加,。PCR的原理:PCR的基本過程類似于DNA的天然復制,,特異性依賴于與靶序列兩端互補的Oligo引物。整個過程由變性-退火-延伸3個基本反應步驟構(gòu)成,。

PCR實驗中擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散的原因如下:

(1)酶量過高,。減少酶量;酶的質(zhì)量差,,調(diào)換另一來源的酶,。

(2)dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度,。

(3)MgCl2濃度過高,。可適當降低其用量,。

(4)模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng,而基因組DNA則應<200ng,。

(5)引物濃度不夠優(yōu)化,。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。

(6)循環(huán)次數(shù)過多,;增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,,縮短退火時間及延伸時間,或改用二種溫度的PCR循環(huán),。

(7)退火溫度過低,。

(8)電泳體系有問題:

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;

②凝膠沒有凝固好,;

③瓊脂糖質(zhì)量差,。

(9)若為PCR試劑盒則可能:

①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效;

②試劑盒本身質(zhì)量有問題,,如引物選擇,、循環(huán)參數(shù)等選擇不當,。

(10)降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布。

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