多肽合成的原理與步驟
多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程,,固相合成順序一般從C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成,。過(guò)去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法,。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來(lái),,經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善,,到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù),,表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法*的優(yōu)點(diǎn),,從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。
1.1多肽合成基本原理:
先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)同一個(gè)不溶性的高分子樹脂相連,,然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化羧基組分反應(yīng),,接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)(縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合)操作,,達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度,,zui后將肽鏈從樹脂上裂解下來(lái),經(jīng)過(guò)純化等處理,,即得所要的多肽,。其中α-氨基用BOC(叔丁氧羰基)保護(hù)的稱為BOC固相合成法,α-氨基用FMOC(9-芴甲氧羰基)保護(hù)的稱為FMOC固相合成法,。
1.2固相多肽合成的步驟:
A,,樹脂的選擇及氨基酸的固定
用于多肽合成的高分子的載體主要有3類:交聯(lián)聚苯乙烯,;聚酰胺:聚乙烯一乙二醇脂類樹脂。氨基酸的固定主要是通過(guò)保護(hù)的氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵來(lái)實(shí)現(xiàn),。
B,,氨基、羧基,、側(cè)鏈的保護(hù)及脫除
要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽,,需要對(duì)暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護(hù),同時(shí)對(duì)氨基酸側(cè)鏈上的活性基團(tuán)也要保護(hù),,反應(yīng)完成后再將保護(hù)基團(tuán)除去,,近年來(lái),F(xiàn)MOC合成法得到了廣泛的應(yīng)用,。羧基通常用形成酯基的方法進(jìn)行保護(hù),。甲酯和乙酯是逐步合成中保護(hù)羧基的常用方法。
C,,成肽反應(yīng)
固相中的成肽反應(yīng)一般是將兩個(gè)相應(yīng)的氨基被保護(hù)的及羧基被保護(hù)的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵,,要形成酰胺鍵,經(jīng)常用的手段是將羧基活化,,變成混合酸酐,、活潑酯、酰氯或用強(qiáng)的縮合劑(如碳二亞氨)形成對(duì)稱酸酐等方法來(lái)形成酰胺鍵,。
D,,裂解及合成肽鏈的純化
BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基,F(xiàn)MOC法直接用TFA,,有時(shí)根據(jù)條件不同,,其它堿、光解,、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用,。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用液相色譜,、親和層析,、毛細(xì)管電泳等。