ELISA實驗的原理ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性,，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性,。在測定時,，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面 [底物顯色 ELISA實驗原理 固相載體 雙抗體夾心法 抗體 抗原 包被]。

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法,，操作步驟如下：

1) 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2) 加受檢標本,，保溫反應(yīng),。標本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復合物,。 洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì),。

3) 加酶標抗體，保溫反應(yīng),。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合,。*洗滌未結(jié)合 的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關(guān),。

4) 加底物顯色,。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色,，測知標本中抗原的量,。 在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,，例如HBsAg,、HBeAg、AFP,、hCG等,。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法,。如抗體的來源為抗血清,，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應(yīng)用單克隆抗體,，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗,，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性,，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應(yīng),，作一步檢測。
    

在一步法測定中,，當標本中受檢抗原的含量很高時,，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結(jié)合，而不再形成"夾心復合物",。類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象,，此時反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見1.3.2，圖1-4),，如按常法測讀,，所得結(jié)果將低于實際的含量,，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect)，因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落,。鉤狀效應(yīng)嚴重時,，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg,、AFP和尿液hCG等)時,，應(yīng)注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng),。
    

假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇,，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結(jié)合物,。但在HBsAg的檢測中應(yīng)注意亞型問題,，HBsAg有adr、adw,、ayr,、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應(yīng)性,，這也是用單抗作夾心法應(yīng)注意的問題,。

雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子(RF)的干擾。RF是一種自身抗體,，多為IgM型,，能和多種動物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF,，它可充當抗原成份,，同時與固相抗體和酶標抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽性反應(yīng),。采用F(ab')或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑，由于去除了Fc段,，從而消除RF的干擾,。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標(參見6.2),。
    

雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心,。