在ELISA試劑盒操作中，我們都認(rèn)為ELISA實(shí)驗(yàn)的原理似乎很簡(jiǎn)單,，不外乎固定抗原,，添加一抗、二抗和底物,，間中夾雜著洗滌和封閉,。然而，即使是平淡無(wú)奇的洗滌和封閉,，如果做得不太好,，也有可能毀了整個(gè)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),，我們是否能獲得有意義的信息,，這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。背景噪音會(huì)影響您對(duì)結(jié)果的判斷,。如何降低ELISA的背景,，下面有一些tips。
ELISA原理
一,、洗滌很重要
洗滌步驟看似很無(wú)聊,，其實(shí)很重要,，因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測(cè)試劑)殘留在微孔板中,，那么它會(huì)增加背景噪音。如有必要,，可增加洗滌液中的鹽濃度,，這會(huì)阻止非特異結(jié)合反應(yīng)。如果背景過(guò)高,，而您懷疑洗滌不夠時(shí),，可以嘗試增加洗滌次數(shù)。
二,、封閉更關(guān)鍵
封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn),。這就降低了可產(chǎn)生信號(hào)的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會(huì)。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧,。如果您的背景過(guò)高,，懷疑封閉不充分,，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液，或適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間,。
如果您一直被背景問(wèn)題所困擾,，那么也許您該花些時(shí)間來(lái)優(yōu)化封閉液。這可能需要時(shí)間,，但也是值得的,。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑。您使用的類型須取決于多個(gè)因素,，包括微孔板的表面試劑,、吸附的抗原、您的抗體和檢測(cè)試劑,。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合,，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原、抗體或檢測(cè)試劑發(fā)生相互作用,。
ELISA試劑盒zui常用的非離子型去污劑是Tween-20,。這種封閉液便宜、穩(wěn)定,，在去除洗滌過(guò)程中的一些非特異結(jié)合上很有用,。但它們只在存在時(shí)起作用，因?yàn)楹苋菀妆幌吹?。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液,。請(qǐng)勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會(huì)降低特異結(jié)合,，產(chǎn)生假陰性,。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過(guò)程中的封閉,。
蛋白封閉液則有所不同,，是*的。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,，同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子,。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉,、正常血清和魚明膠,。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過(guò),，它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用,。解決這個(gè)問(wèn)題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。
三、抗體濃度須優(yōu)化
我們通常會(huì)follow師兄師姐留下來(lái)的操作步驟,，但是如果試劑稍有不同,，則可能需要優(yōu)化抗體的量。記住,，非特異的抗體結(jié)合會(huì)增加背景,。為了防止這一點(diǎn)，切勿使用過(guò)多的一抗或二抗,。
四,、檢測(cè)試劑要適量
另一點(diǎn)也很顯而易見(jiàn)：切勿使用過(guò)多的檢測(cè)試劑。如果濃度過(guò)高,，或者未正確稀釋,，則會(huì)導(dǎo)致高背景。也不要顯色過(guò)度,，如有必要,，優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。
如果您的ELISA試劑盒操作中不幸地遇到了高背景,，那么也無(wú)需太擔(dān)心,，依次查看ELISA系統(tǒng)中的組分，并排除可能存在的問(wèn)題,。悉心優(yōu)化,，相信很快就會(huì)有漂亮的結(jié)果。