在您的科研生涯的某個(gè)時(shí)候，都有可能會(huì)用到熒光顯微鏡,。這種無(wú)處不在的技術(shù)改變了顯微鏡學(xué)家對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行成像,、標(biāo)記和追蹤的方式，不論是整個(gè)生物體,，還是單個(gè)蛋白質(zhì)等等,。
通過(guò)本文，我們將探討什么是“熒光",，包括其定義背后的歷史和基礎(chǔ)物理原理,，綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，并展望量子點(diǎn)等熒光探針不斷擴(kuò)大的應(yīng)用領(lǐng)域,。


我們?nèi)绾味x“熒光",？
在任何搜索引擎中輸入“熒光的定義"，你會(huì)得到以下語(yǔ)句,，或者非常相似的內(nèi)容,；
“由較短波長(zhǎng)的入射輻射，如X射線(xiàn)或紫外線(xiàn),，某些物質(zhì)會(huì)發(fā)出可見(jiàn)或不可見(jiàn)的輻射,。"
這個(gè)定義與熒光顯微鏡（圖1）有何關(guān)聯(lián)呢？“波長(zhǎng)較短的入射輻射"只是用來(lái)“激發(fā)"樣品發(fā)射熒光的光源,。這種光線(xiàn)包括可見(jiàn)光,、紫外線(xiàn)（UV）和紅外線(xiàn)（IR），顯微鏡的光源可以是汞或氙弧光燈,，也可以是激光,。熒光基團(tuán)（即上述定義中的“某些物質(zhì)"）是具有特殊性質(zhì)的化合物,，它們?cè)谳^短波長(zhǎng)光線(xiàn)的激發(fā)下,，可以再次發(fā)射較高波長(zhǎng)的光線(xiàn)/光子。

 
圖1：熒光顯微鏡下顯示的熒光標(biāo)記細(xì)胞,。
波長(zhǎng)的基本單位是米,，“波長(zhǎng)"定義為光波的兩個(gè)連續(xù)波峰或波谷之間的距離。波長(zhǎng)的符號(hào)是希臘字母λ(l),。顯微鏡使用的波長(zhǎng)通常以納米（nm）為單位,，可見(jiàn)光譜段在400至700納米之間，紫外光譜段在400納米以下,，紅外光譜段從700納米開(kāi)始（圖2）,。

 
圖2：可見(jiàn)光光譜
熒光基團(tuán)按其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分類(lèi)，通常以圖形的形式顯示最大波峰。熒光基團(tuán)在所謂的“基態(tài)"中自然穩(wěn)定,。它們吸收到（來(lái)自“較短波長(zhǎng)"入射光的）光子時(shí),，光子的能量將熒光基團(tuán)的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。被激發(fā)的電子不會(huì)保持在這種狀態(tài),，而會(huì)失去振動(dòng)能量,，并在返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出一個(gè)較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。對(duì)于顯微鏡使用熒光基團(tuán),，從激發(fā)到返回基態(tài)的一個(gè)完整周期需要0.5到20納秒,。
熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)通常縮寫(xiě)為希臘字母lambda,，加上下標(biāo)“ex"（激發(fā)）或“em"（發(fā)射,；即lex或lem）。
每個(gè)熒光基團(tuán)都有一個(gè)不同的最大激發(fā)和發(fā)射譜段,，這一特性用來(lái)區(qū)分同一樣品中的不同標(biāo)靶,。例如，使用熒光染色劑DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚）高亮顯示細(xì)胞中的核蛋白,，同時(shí)使用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽來(lái)高亮顯示肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,。
熒光的雅布隆斯基圖
波蘭物理學(xué)家亞歷山大·雅布隆斯基（Aleksander Jablonski，1898-1980）首先用三能級(jí)能量圖描述了基態(tài)/激發(fā)/發(fā)射之間的循環(huán),，因此稱(chēng)為“雅布隆斯基圖",。  1930年，他憑借題為《關(guān)于激發(fā)光波長(zhǎng)變化對(duì)熒光光譜的影響》的論文獲得華沙大學(xué)博士學(xué)位,。1933年,，他在《自然》雜志上發(fā)表了自己的論文（《染料中反斯托克斯熒光的效率》"），其中含有雅布隆斯基圖,。這種簡(jiǎn)單而有效的示意圖清晰表現(xiàn)出熒光基團(tuán)從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的激發(fā)行為,，然后在發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)光子后回到基態(tài)（圖3）。

 
圖3：熒光雅布隆斯基圖,。熒光基團(tuán)會(huì)吸收光子,。光子的能量將熒光基團(tuán)的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。隨后,，激發(fā)的電子失去振動(dòng)能量,，并在返回基態(tài)時(shí)發(fā)射一個(gè)較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。
 
雖然圖3是簡(jiǎn)化版的雅布隆斯基圖,，但應(yīng)該可以注意到,，熒光基團(tuán)可以存在多個(gè)不同的激發(fā)和發(fā)射狀態(tài)。此外,，熒光基團(tuán)可以通過(guò)不同的弛豫狀態(tài)返回基態(tài),，這些弛豫狀態(tài)被稱(chēng)為“三重態(tài)",，具體取決于分子的電子自旋。
斯托克斯位移
喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士（1819-1903）是愛(ài)爾蘭數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家,，他一生中在光學(xué)和光線(xiàn)領(lǐng)域頗有建樹(shù),。1849年他受命擔(dān)任劍橋彭布羅克學(xué)院的盧卡斯數(shù)學(xué)教授，并一直擔(dān)任該職務(wù),，直到1903年離開(kāi),。他寫(xiě)了一篇文筆優(yōu)美的描述性論文，發(fā)表于1852年,，名為《論光的折射性的變化》[1],。他在論文中使用的語(yǔ)言不同于我們?cè)诂F(xiàn)代科學(xué)文獻(xiàn)中使用的語(yǔ)言。以下是斯托克斯爵士所用精彩語(yǔ)言的兩段簡(jiǎn)短摘錄,；
“去年深秋,，雖然因?yàn)楣?jié)氣遲來(lái)，觀(guān)察機(jī)會(huì)不多,，我從不同渠道得知,，之前提到過(guò)的那種具有高內(nèi)色散性的黃色玻璃采用氧化鈾染色。"
以及：
“看到試管在浸入不可見(jiàn)光線(xiàn)的瞬間點(diǎn)亮,，這當(dāng)然是一個(gè)奇怪的景象：那實(shí)際上是可見(jiàn)的黑暗,。總的來(lái)說(shuō),，這種現(xiàn)象有點(diǎn)不可思議,。"
“斯托克斯位移"這詞就是為了紀(jì)念這位科學(xué)家。當(dāng)激發(fā)的電子回到基態(tài)并發(fā)出光子時(shí),，其波長(zhǎng)始終大于激發(fā)熒光基團(tuán)的入射光線(xiàn)的波長(zhǎng),。這是由于光的特性，即波長(zhǎng)與輻射能量成反比,。斯托克斯位移描述了熒光基團(tuán)的峰值激發(fā)波長(zhǎng)和峰值發(fā)射波長(zhǎng)之間的差值（以納米為單位）（圖4）,。

 
圖4：斯托克斯位移發(fā)射光的波長(zhǎng)始終大于用來(lái)激發(fā)熒光基團(tuán)的光線(xiàn)波長(zhǎng)。
增加斯托克斯位移,，熒光基團(tuán)的激發(fā)光和發(fā)射光之間區(qū)別就越明顯,。熒光基團(tuán)的電子排布和分子結(jié)構(gòu)令其在斯托克斯位移方面有著*的性質(zhì)。
綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用
斯托克斯爵士首先使用“熒光"這個(gè)術(shù)語(yǔ)來(lái)描述他觀(guān)察到的現(xiàn)象,，但其發(fā)現(xiàn)可以追溯到1565年,。來(lái)自西班牙的醫(yī)生兼植物學(xué)家尼古拉斯·莫納德斯（Nicolas Monardes）描述了一種墨西哥樹(shù)（Lignum nephriticum）,，其木頭被注入了奇怪的藍(lán)色,。盡管有這些早期的觀(guān)察，但直到約400年后,，人們才在活體組織中找到一種綠色熒光物質(zhì),。1955年,，Davenport和Nicol發(fā)表論文[2]，描述了一種在稱(chēng)為水螅水母（Hydromedusae）的水母亞綱生物的嗜酸性粒細(xì)胞中找到的發(fā)光組織,。當(dāng)時(shí),，兩位論文作者并沒(méi)有意識(shí)到這些嗜酸性粒細(xì)胞含有綠色熒光蛋白（GFP）。
直到1962年,，下村脩（Osamu Shimomura,，出生于1928）發(fā)表了一篇論文[3]，認(rèn)定這種發(fā)光成分是一種蛋白質(zhì),。通過(guò)與他在普林斯頓大學(xué)的老師（弗蘭克·*教授）合作,，他們從生物發(fā)光水母Aequorea Victoria（維多利亞多管發(fā)光水母）身上收集到樣本。他們用一種*的方法從水母中分離出熒光蛋白,，即通過(guò)棉布袋擠壓分離的生物發(fā)光組織,，產(chǎn)生一種被下村稱(chēng)為“擠壓物"的溶液。
1994年,，哥倫比亞大學(xué)的馬丁·查爾菲（Martin Chalfie,，出生于1947年）教授發(fā)表論文，證明了基因編碼GFP可以在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞（即大腸桿菌和秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的神經(jīng)元）中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)[4],。該論文寫(xiě)道“由于這種熒光不需要外源底物和輔助因子,，GFP表達(dá)可以用于監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位。"正是這篇文章的發(fā)表為GFP在生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用鋪平了道路,。

 
圖5：線(xiàn)蟲(chóng),，GFP在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)。
一年后,，一直在研究野生型GFP突變體的加州大學(xué)圣迭戈分校教授錢(qián)永?。?952-2016）在《自然》的科學(xué)通訊上發(fā)表了自己的論文[5]。錢(qián)教授和他的同事發(fā)現(xiàn),，他們選擇的一個(gè)單點(diǎn)突變（S65T）具有最長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(490/510nm),，這令它更具有光穩(wěn)定性，并帶來(lái)大家都知道的GFP激發(fā)/發(fā)射峰,。
2008年,，下村脩、錢(qián)永健和查爾菲因在GFP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用方面發(fā)揮的重要作用共同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),。下村脩在他的諾貝爾演講中表示,，“當(dāng)我在1979年發(fā)現(xiàn)GFP的發(fā)色團(tuán)時(shí)，我認(rèn)為自己已經(jīng)完成了所有研究工作,，因而決定終止我在GFP方面的工作,，以便集中精力研究生物發(fā)光"。他接著承認(rèn),，“GFP是一種美麗的蛋白質(zhì),，但在發(fā)現(xiàn)之后的30年中,，它依然百無(wú)一用。"
自從錢(qián)永健發(fā)現(xiàn)GFP的應(yīng)用之后,，他的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)計(jì)出多種GFP變體,，涵蓋了大部分的可見(jiàn)光譜，并*改變了光學(xué)顯微鏡和成像領(lǐng)域,。得益于這種基因工程,，GFP的色彩范圍從光譜的藍(lán)色譜段（EBFP；380/460納米）到光譜的黃色譜段（YFP,；514/527納米）,。
報(bào)告基因和探針
除了成像領(lǐng)域，熒光團(tuán)可以作為研究細(xì)胞和生物體中基因表達(dá)的“報(bào)告基因",。熒光素酶以及基因編碼GFP,，就是檢查細(xì)胞是否表達(dá)特定基因的常用報(bào)告基因。生物體或細(xì)胞被基因改造的病毒DNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,，當(dāng)目標(biāo)基因獲得表達(dá)時(shí),，這些質(zhì)粒會(huì)發(fā)出熒光。細(xì)胞內(nèi)部的相關(guān)細(xì)胞器或位點(diǎn)可以在受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行觀(guān)察和檢查,。
利用熒光基團(tuán)標(biāo)記（或“標(biāo)注"）的抗體通常稱(chēng)為“熒光探針",。在GFP和其他熒光基團(tuán)得到廣泛應(yīng)用之前，兩種常用的熒光基團(tuán)標(biāo)記抗體是FITC（異硫氰酸熒光素）和TRITC（異硫氰酸四甲基羅丹明）,。盡管FITC和TRITC仍在使用,，但該領(lǐng)域已取得重大進(jìn)展，至少可以說(shuō),，熒光基團(tuán)和探針的選擇非常廣泛,。
當(dāng)然，如今實(shí)驗(yàn)室中使用最為廣泛的熒光基團(tuán)之一是“Alexa Fluor"染色劑,。目前Alexa Fluor染色劑的可用色彩范圍已超越可見(jiàn)光譜,，其中激發(fā)波長(zhǎng)范圍可達(dá)346至784納米。
量子點(diǎn)
1981年,，俄羅斯科學(xué)家阿列克謝·?；颍ˋlexey Ekimov）在圣彼得堡瓦維洛夫國(guó)立光學(xué)研究所工作時(shí)，第一次在玻璃基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了量子點(diǎn),。然而,，在新澤西州AT&T貝爾實(shí)驗(yàn)室從事半導(dǎo)體工作的路易斯·布魯斯（Louis Brus）首先發(fā)現(xiàn)了量子點(diǎn)膠體溶液。他現(xiàn)在是哥倫比亞大學(xué)化學(xué)系教授,。在1983年和1984年發(fā)表的兩篇論文中,，布魯斯將量子點(diǎn)描述為“小型半導(dǎo)體微晶"。
量子點(diǎn)有著奇特的行為方式,，盡管它們包含100到10萬(wàn)個(gè)原子,，但它們表現(xiàn)出的性質(zhì)就像它們由單個(gè)原子組成一樣。當(dāng)然,，它們確實(shí)符合熒光基團(tuán)的性質(zhì),，即它們可以吸收光能并激發(fā)，然后在返回基態(tài)時(shí)釋放光子,。不過(guò),，量子點(diǎn)發(fā)射光線(xiàn)的波長(zhǎng)取決于量子點(diǎn)的大小，即量子點(diǎn)越小,，發(fā)射波長(zhǎng)就越短,。這種特性是因?yàn)檩^小的量子點(diǎn)具有較大的“最小帶隙"。這正是激發(fā)電子到更高能態(tài)所需的能量,。由于較小的量子點(diǎn)需要更多的激發(fā)能量,，它們隨后會(huì)發(fā)射較短波長(zhǎng)的光（波長(zhǎng)與激發(fā)能量成反比）。
大約20年后,，即2002年,，加州量子點(diǎn)公司的生命科學(xué)研究人員實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)的商用開(kāi)發(fā)。
量子點(diǎn)是一種非常明亮且穩(wěn)定的熒光工具,。研究表明,，量子點(diǎn)的的亮度比傳統(tǒng)熒光基團(tuán)高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，盡管與有機(jī)染料相比,，量子點(diǎn)的明亮程度存在一些差異[6],。就光穩(wěn)定性而言，量子點(diǎn)的穩(wěn)定性是傳統(tǒng)熒光基團(tuán)的100倍,，在一項(xiàng)活體成像研究中,，量子點(diǎn)的熒光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月[7]。
在傳統(tǒng)熒光探針中,，一個(gè)或多個(gè)熒光基團(tuán)可以附著在單個(gè)相關(guān)抗體上,。然而，由于量子點(diǎn)的表面積非常大,，許多分子和抗體可以附著在單個(gè)量子點(diǎn)上,，這會(huì)帶來(lái)許多優(yōu)點(diǎn)，包括熒光信號(hào)放大,。量子點(diǎn)的使用也為多重分析提供了優(yōu)勢(shì),，可以在檢測(cè)中同時(shí)對(duì)各種波長(zhǎng)進(jìn)行成像。在這種分析中,，變量是研究者選擇的量子點(diǎn)大?。ㄒ虼税l(fā)射波長(zhǎng)）?？梢允褂冒坠馔瑫r(shí)激發(fā)大范圍的量子點(diǎn),，這樣就可以避免使用多道激光和多次調(diào)整來(lái)形成最終影像,。