熒光壽命的概念

熒光壽命是熒光分子在激發(fā)態(tài)停留的時(shí)間,，這個(gè)時(shí)間可以反映熒光分子的內(nèi)在屬性和所處的微環(huán)境，是一個(gè)很有用的工具。以往，熒光壽命的測(cè)量和計(jì)算是件非常復(fù)雜和耗時(shí)的工作，只有少數(shù)專業(yè)的科學(xué)家關(guān)注和使用該工具,。最近幾年，隨著新技術(shù)的發(fā)展,，熒光壽命數(shù)據(jù)的獲得越來越容易,，也被更多的生命科學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家來利用熒光壽命進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)德國馬普醫(yī)學(xué)研究所的Kai Johnsson研究組長(zhǎng)期致力于開發(fā)新的蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)，近期,，他們利用熒光壽命來輔助開發(fā)新的蛋白標(biāo)記,，在2021年4月在BioRxiv上刊發(fā)了題為“

HaloTag9: an engineered protein tag to improve fluorophore performance"的研究論文。

俗話說巧婦難為無米之炊,，科學(xué)實(shí)驗(yàn)第一步就是拿到好的材料,。作者鎖定了常用的標(biāo)簽蛋白Halo7，將其改造成了壽命更長(zhǎng)的Halo9,。

Halo9的前世今生：

Halo7標(biāo)簽蛋白由于其分子量小,、易于表達(dá)、無生物毒性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在原核和真核表達(dá)系統(tǒng)中,。將Halo7標(biāo)簽蛋白與目的蛋白重組后,，用帶有氯代烷烴的熒光配基與Halo蛋白發(fā)生脫鹵素反應(yīng)形成酰胺鍵共價(jià)結(jié)合，即可實(shí)現(xiàn)熒光配基對(duì)目的蛋白的標(biāo)記（圖1A和1B）,。

該實(shí)驗(yàn)室用點(diǎn)飽和突變的方式對(duì)Halo7進(jìn)行了改造,，篩選得到的Halo9與熒光配基MaP618結(jié)合后，熒光強(qiáng)度較Halo7增加了近百分之四十,。更為重要的是熒光壽命發(fā)生了改變,，從3.1ns（HaloTag7-MaP618）提升到3.7ns（HaloTag9-MaP618）（圖1D）。

圖1 Halo標(biāo)簽蛋白工作原理及改造示意圖

材料拿到之后,，我們看下作者是如何利用熒光壽命技術(shù)對(duì)這來之不易的材料玩出新花樣的吧,。
花樣一：根據(jù)熒光壽命進(jìn)行光譜之外的拆分

Halo7與Halo9聯(lián)用實(shí)現(xiàn)單通道多色成像

作者構(gòu)建了H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達(dá)細(xì)胞系，使用MaP555-CA來同時(shí)標(biāo)記HaloTag7與HaloTag9,，用MaP555-Actin來標(biāo)記F-actin, 而MaP555-Actin與MaP555光譜相同,，所以系統(tǒng)僅采用一個(gè)光譜通道完成圖像采集，再通過Phasor根據(jù)熒光壽命拆分出三個(gè)通道,，分別是MaP555-CA-H2B-HaloTag7標(biāo)記的細(xì)胞核,、MaP555-CA-Tommo20-HaloTag9標(biāo)記的線粒體和MaP555-Actin標(biāo)記的細(xì)胞骨架（圖2）。

這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)在哪里呢,？傳統(tǒng)的多色成像實(shí)驗(yàn)根據(jù)光譜差異來設(shè)計(jì),，會(huì)有串色等限制，而且需要多次采集圖像,，會(huì)造成樣品的光損傷,。通過熒光壽命來進(jìn)行成像,，僅需要拍攝一次就完成圖像采集,，不僅減少了成像時(shí)間,，而且降低了激光對(duì)樣品的損傷。

圖2 單通道三色熒光成像

綠色,，H2B-Halo7標(biāo)記細(xì)胞核,；紫色，Tomm20-Halo9標(biāo)記線粒體,；藍(lán)色,，MaP555-Actin標(biāo)記微絲。Halo7與Halo9配基均為MaP555-CA,。Ex：550,，Em：570-620。

花樣二：利用熒光壽命進(jìn)行超高分辨成像——TauSTED

H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功后,，作者對(duì)該細(xì)胞做了STED超高分辨成像,。由于只用了一個(gè)染料MaP555去同時(shí)標(biāo)記HaloTag7與HaloTag9， STED成像時(shí)僅需要一次depletion過程就完成圖像采集,。后期通過Phasor云圖將H2B和Tomm20的未受受激輻射的長(zhǎng)壽命的光子分離出來,，即得到背景更純凈的雙色STED圖像（圖3）。

圖3 單通道TauSTED雙色成像

第一行,，共聚焦成像結(jié)果,；第二行，TauSTED成像結(jié)果,；第三行 ,，共聚焦與TauSTED成像Phasor圖對(duì)比。綠色,，H2B-Halo7標(biāo)記細(xì)胞核,；紫色，Tomm20-Halo9標(biāo)記線粒體,，配基均為MaP618-CA,。Ex：615，Em：630-760,。

技術(shù)盤點(diǎn)——TauSTED

STED技術(shù)通過一束環(huán)形的STED激光來干涉熒光衍射環(huán)的外圈發(fā)生受激輻射從而產(chǎn)生擦除效果,，從而突破衍射極限實(shí)現(xiàn)超高分辨率成像。TauSTED技術(shù)創(chuàng)造性地將STED與熒光壽命技術(shù)結(jié)合,，XY分辨率可達(dá)到30nm,，獲得高分辨率的同時(shí)可顯著降低STED激光強(qiáng)度保護(hù)樣本。TauSTED特別適合應(yīng)用于組織和細(xì)胞內(nèi)微小結(jié)構(gòu)和物質(zhì)的觀察,，如膜蛋白與膜微結(jié)構(gòu)域,、細(xì)胞器內(nèi)部的微小結(jié)構(gòu)觀察,、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、蛋白復(fù)合物等,。

圖4 TauSTED成像對(duì)比

從左往右,，傳統(tǒng)共聚焦成像，2%STED激光強(qiáng)度傳統(tǒng)STED成像,，2%STED激光強(qiáng)度TauSTED成像,。

花樣三：利用熒光壽命技術(shù)改造Biosensor

Fucci（Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator）是一種監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期的biosensor。Fucci(CA) 將細(xì)胞周期依賴性的降解片段hCdt與hGem分別連接綠色和紅色熒光蛋白,，根據(jù)得到的兩種熒光蛋白的強(qiáng)度比例來區(qū)分四種不同的細(xì)胞周期G1期,、S期、G2期和M期,。作者將此biosensor中的兩種熒光蛋白分別用HaloTag7和HaloTag9進(jìn)行置換,，根據(jù)此兩種Tag熒光壽命的不同來指示細(xì)胞周期，構(gòu)建了基于熒光壽命成像的Fucci(CA) -LT,。

作者使用TauSense工具測(cè)得HT7-hGem的AAT（Average photon arrival time,，平均光子到達(dá)時(shí)間）較短，用于指示S期,，HT9-hCdt的AAT較長(zhǎng),，用于指示G1期，而G2和M期混雜了兩種成分,，測(cè)得的AAT處于中間水平（圖5A）,。由于HaloTag可以用不同的染料進(jìn)行標(biāo)記，F(xiàn)ucci(CA)-LT構(gòu)建成功之后,，實(shí)驗(yàn)人員可以任意更換與HaloTag搭配的不同顏色的探針,，靈活性更強(qiáng)。此外,，作者還將TauSense測(cè)得的圖與FastFLIM測(cè)得的圖進(jìn)行了對(duì)比（圖5B）,，結(jié)果顯示兩種測(cè)量方法的一致性很高。對(duì)比基于光譜的Fucci（CA）,，基于熒光壽命的Fucci(CA)-LT只需要一個(gè)成像通道就完成實(shí)驗(yàn),，光毒性較Fucci(CA)降低了一半，在長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像中更具有優(yōu)勢(shì)（視頻1）,。

圖5 基于熒光壽命構(gòu)建Fucci（CA）biosensor,，追蹤細(xì)胞周期

A，F(xiàn)ucci（CA）-LT工作原理示意,；B,，F(xiàn)ucci（CA）-LT 指示細(xì)胞周期，TauContrast與FastFLIM測(cè)量結(jié)果對(duì)比,，無明顯差異,。

視頻1 TauSense長(zhǎng)時(shí)程（24小時(shí)）活細(xì)胞成像

技術(shù)盤點(diǎn)——TauSense
TauSense用平均光子到達(dá)時(shí)間（Average photon arrival time,，AAT）來指示熒光壽命，使用簡(jiǎn)單,，方便快捷,，不需要進(jìn)行參數(shù)調(diào)節(jié)，幫助您快速挖掘樣品熒光壽命信息,。它包含三個(gè)子工具,，TauContrast可以一鍵獲取樣品的熒光強(qiáng)度信息和壽命信息,，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期變化,、離子濃度的變化、組織的代謝變化等,；TauGating根據(jù)AAT的長(zhǎng)短來設(shè)置時(shí)間窗口,，可以將樣品中短壽命的自發(fā)熒光、雜散光等去除掉,；TauSeparation基于AAT的區(qū)別將檢測(cè)到的信號(hào)進(jìn)行拆分,，即使所用的染料發(fā)射光譜*重合，TauSeparation也能將其拆分成多個(gè)通道,。

圖6 用TauGating去除擬南芥葉片細(xì)胞壁自發(fā)熒光

左圖：普通模式成像,；右圖：TauGating成像。紅色：葉綠體,；綠色：線粒體,；門控窗口：0.3-12ns。

圖7 TauSeparation技術(shù)用于NE-115細(xì)胞雙通道四色成像

左圖：灰色,，NUC Red（細(xì)胞核）和SiR-tubulin（微管）,；黃色，Act-mNeoGreen（微絲）和MitoTracker Green（線粒體）,，光譜兩兩串色不可拆分,。右圖：藍(lán)色，NUC Red(細(xì)胞核);洋紅色,，SiR-tublin(微管),；紅色，Act-mNeonGreen(微絲),；綠色,，MitoTracker Green(線粒體)。

總結(jié)  
本論文通過改造HaloTag7得到了壽命更長(zhǎng)的HaloTag9,，HaloTag7與HaloTag9聯(lián)合使用,，僅需要一種染料標(biāo)記即可實(shí)現(xiàn)多色成像。用此種方法進(jìn)行TauSTED成像時(shí),，可通過phasor將熒光壽命進(jìn)行拆分,，一次depletion過程完成雙色STED成像,，減少了光損傷。用此方法構(gòu)建的Fucci(CA)-LT biosensor監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期,，可以自由選擇熒光配基的種類,，應(yīng)用更靈活。

科研小靈感：
標(biāo)簽蛋白何其多,，biosensor何其多,。選取一個(gè)切入點(diǎn)，開動(dòng)腦筋改一改,，熒光壽命技術(shù)用起來,，說不定就成功了呢？

參考文獻(xiàn)

【1】Deo, C. et al. The HaloTag as a general scaffold for far-red tunable chemigenetic indicators. Nat. Chem. Biol. (2021). doi:10.1038/s41589-021-00775-w

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【3】Roberti, M. J.

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