相分離/相變

（Phase separation,，Phase Transition）

相分離/相變是近幾年生化,、細(xì)胞生物學(xué)新興且十分火熱的研究領(lǐng)域。Hyman和Brangwynne 2009年在Science發(fā)表了題為：Germline P granules are liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation 的文章,，提出了細(xì)胞內(nèi)通過“相分離",，可以提供一種特定的方式讓細(xì)胞內(nèi)的特定分子聚集起來，從而在“混亂的"細(xì)胞內(nèi)部形成一定“秩序",，為困擾了大家多年的問題,，提供了全新的思路。
 

分離或相變（Phase separation,，Phase transition）描述的是細(xì)胞里不同成分間相互碰撞,、融合形成液滴，從而使一些成分被包裹在液滴內(nèi),、一些成分被阻隔在液滴外的現(xiàn)象,，就如同水油相混，細(xì)胞里的不同成分也會相互分離,，形成液滴,，這就是相分離。后續(xù)的大量研究也讓生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)相分離在細(xì)胞生物學(xué)中無處不在,。2011年,，Hyman, Mitchison 和 Brangwynne又發(fā)現(xiàn)核仁有液滴現(xiàn)象，后續(xù)研究相繼發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)分子間存在較弱的作用力,，形成液滴類的物質(zhì),、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)存在相分離現(xiàn)象；至2018年CNS上已發(fā)表十幾篇重要級文章證實(shí)相分離的廣泛存在和重要性,。
 

圖1. 細(xì)胞內(nèi)的油滴藝術(shù) 
 

細(xì)胞內(nèi)的相分離

細(xì)胞中存在各種無膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器：顆粒,、核仁、Cajal bodies,、stress granules,、miRISC及突觸的細(xì)胞骨架等，相分離廣泛發(fā)生于各種成分之間,。
 

蛋白質(zhì)或RNA分子

蛋白質(zhì)或RNA分子間的物理作用力可以使它們相互分開或聚集,。一旦分子達(dá)到一定濃度，它們就會發(fā)生相分離,，相似的成分聚集在一起加速生物學(xué)反應(yīng)（類似于相似相容）,，或者隔離無關(guān)的分子。
 

細(xì)胞膜上的信號傳遞

在神經(jīng)細(xì)胞中,，細(xì)胞間進(jìn)行信號傳遞時,，蛋白質(zhì)在連接處的聚集和相分離是保證細(xì)胞間信號傳遞正常進(jìn)行所必需的。
 

DNA折疊包裝

在細(xì)胞核中，相分離幫助壓縮折疊不使用的DNA并抑制其活性,。一些可能與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白被阻隔在外,。
 

液滴成為障礙 

在肌萎性脊髓側(cè)索硬化癥中，分離成液滴的蛋白質(zhì)會逐漸凝結(jié),、變硬,，形成有害的固體物質(zhì)。

圖2. 細(xì)胞內(nèi)的相分離

相分離的主要應(yīng)用

隨著相分離的研究逐漸增多,，研究人員發(fā)現(xiàn)相分離在無膜器官的形成,、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架,、超分子組裝,、基因激活等方面起著重要作用，相分離異?？赡軐?dǎo)致如神經(jīng)退行性疾病,、腫瘤、衰老等,。
 

神經(jīng)退行性疾病

在肌萎側(cè)索硬化（ALS） （一種運(yùn)動神經(jīng)元疾?。?中觀察到“相分離"，發(fā)現(xiàn)FUS蛋白和hnRNPA1在ALS中形成液滴,，液滴粘性逐漸變強(qiáng),，最終形成纖維狀的固體，在ALS中異常沉積,。
 

阿爾茨海默病患者腦內(nèi)異常沉積的tau蛋白也存在相分離,，相分離可能是tau蛋白聚集的初始觸發(fā)因素。

圖3. FUS蛋白相分離作用圖解,；FUS蛋白相分離熒光圖像
 

腫瘤

分子病理學(xué)家Miguel Rivera和他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了一種與尤文氏肉瘤有關(guān)的蛋白,。這種蛋白聚集在與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因組附近時可激活致癌基因表達(dá)，而異常的相分離就可能促使這種蛋白在這些區(qū)域附近聚集,。
 

細(xì)胞保護(hù)作用

Hyman和Alberti發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞在低pH的壓力環(huán)境下,，一些重要蛋白會聚集成液滴啟動保護(hù)機(jī)制。當(dāng)pH回升后,，這些液滴會分散開,，細(xì)胞恢復(fù)正常的功能。
 

相分離研究中使用的主要技術(shù)

研究相分離涉及的相關(guān)步驟及技術(shù)有很多,，首先通常會用到體外重構(gòu)相分離,，通過將目標(biāo)物質(zhì)表達(dá)純化，在體外重構(gòu)相分離的過程,，證明存在相分離機(jī)制,。其次,，相分離研究的關(guān)鍵是要證明所研究的目標(biāo)物質(zhì)（蛋白、RNA等）存在動態(tài)可逆的聚集-解聚狀態(tài)變化,，并且這一變化與目標(biāo)物質(zhì)的功能有關(guān),。因此如何證明這種動態(tài)變化狀態(tài)是關(guān)鍵。
 

這一過程包括觀察相分離的技術(shù)以及影響和調(diào)控相分離過程的技術(shù),，如：顯微成像技術(shù),、光調(diào)控系統(tǒng)（OptoDroplets,、CasDrop）,、溶液渾濁度檢測、離心沉淀法,、表面張力測定（反毛細(xì)管速度+被動微流變學(xué)）,、液滴內(nèi)部硬度測定（原子力顯微鏡或光鑷）、聚合物網(wǎng)格孔徑測定（熒光標(biāo)記右旋糖苷）等,。
 

顯微成像作為觀察相分離的主要技術(shù),，在相分離中發(fā)揮著*的作用。按觀察方式主要涉及明場光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡,。明場顯微鏡中主要通過微分干涉（DIC）,、相差（PH）、偏光（POL）等方法觀察體外,、無標(biāo)記的相分離溶液,，可獲得液滴形成過程、大小及隨時間變化,、液滴內(nèi)部纖維性或固態(tài)樣結(jié)構(gòu)各項(xiàng)異性等結(jié)果,。對于體外和體內(nèi)熒光標(biāo)記的研究對象，則采用熒光顯微鏡去觀察并獲取高分辨的液滴形成過程,、大小及隨時間變化的熒光圖像,，以及分子擴(kuò)散性和液滴內(nèi)部分子擴(kuò)散能力等研究。
 

明場顯微鏡

運(yùn)用明場顯微鏡DIC或者PH的功能,，可以獲得：

• 液-液相分離形成的液滴,，得到形成時間、輪廓大小,、融合或裂變擴(kuò)散等信息,；

• 隨著加入藥物處理，可觀察液滴大小變化,、融合或者裂變擴(kuò)散,。

如圖4，在DIC明場顯微鏡模式下觀察隨時間變化,，液滴形態(tài)大小的變化,。

圖4. DIC明場顯微鏡觀察相分離隨時間的變化過程 
 

熒光顯微鏡

因其分辨率高,，能夠清晰觀察靜態(tài)液滴輪廓邊界以及亞細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)（如圖5），對于動態(tài)過程的采集,，也能獲取更為清晰的圖像,，是相分離成像的主要觀察手段。

圖5. 小鼠胚胎干細(xì)胞相分離免疫熒光圖像
 

圖6. HeLa細(xì)胞核中蛋白聚集,、分離形成小液滴
 

激光共聚焦顯微鏡

除了上述檢測液滴輪廓,、大小，融合裂變,、分子結(jié)構(gòu),、定位等實(shí)驗(yàn)外，在激光掃描共聚焦顯微鏡上還可以進(jìn)一步利用熒光漂白后恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（FRAP）檢測液滴中的擴(kuò)散行為,。FRAP實(shí)驗(yàn)原理是使用高強(qiáng)度激光將對選定區(qū)域進(jìn)行漂白,，然后觀測該區(qū)域熒光強(qiáng)度隨時間恢復(fù)的動力學(xué)過程。FRAP是非常有效的研究分子動力學(xué)變化的技術(shù)手段,，它可檢測體外和體內(nèi)的相分離,、可評估液滴內(nèi)部的同質(zhì)性，具備激光功率可控,、靈活照明控制,、靈活選擇漂白區(qū)域等*優(yōu)勢，在相分離研究中能發(fā)揮重要作用,?；诠簿劢癸@微鏡的FRAP實(shí)驗(yàn)除了可以獲取高分辨圖像，還能獲取動態(tài)的漂白恢復(fù)曲線信息（如圖7）,，更好地評估相分離中的動力學(xué)過程,。

圖7. 基于激光共聚焦顯微鏡的FRAP實(shí)驗(yàn)研究相分離
 

如需觀察更為微觀的納米結(jié)構(gòu)，可以使用超高分辨共聚焦顯微鏡,，實(shí)現(xiàn)50nm的解析精度,，也可使用電子顯微鏡做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析。