FALCON-即時產(chǎn)生熒光壽命成像 (FLIM)
我們經(jīng)常聽到別人抱怨熒光壽命測量：“壽命分析太復(fù)雜了,！"但這種情況即將改變,！新技術(shù)和新概念的發(fā)展促進了數(shù)據(jù)評估，意味著熒光壽命成像(FLIM)的速度提高了10倍,，可以媲美標準共聚焦成像,，且操作簡單。
圖為小鼠胚胎的壽命圖像,。722個視野拼接,，擬合出4個獨立的特征壽命。采集時間約1小時-傳統(tǒng)方法約1天,。
熒光過程提供了兩個用于成像的測量參數(shù)：強度和熒光壽命。熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的時間,?？梢酝ㄟ^觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集合來測量熒光染料的典型壽命。我們可以測量圖像中所有像素的典型壽命,，并將這些數(shù)字記入數(shù)組元素,。那就是熒光壽命成像[1](FLIM，也稱為τ-映射）,。典型的熒光壽命范圍在0.2到20納秒之間,。
熒光壽命與熒光染料的濃度無關(guān)。無論樣品結(jié)構(gòu)僅有零星熒光染料還是載滿熒光染料：壽命信號始終相同,，并表明在同一環(huán)境中存在相同的熒光染料,。因此,，熒光壽命不受光漂白的影響。樣品深處的圖像將比表面圖像暗得多——但壽命并沒有改變,。這是壽命測定的主要優(yōu)勢,。
如果分子環(huán)境刺激激發(fā)態(tài)衰變而不發(fā)射光子，則熒光強度會降低（淬滅）,。熒光淬滅是一條單獨的發(fā)射路徑,，因此在動力學(xué)上與熒光過程形成競爭關(guān)系。激發(fā)態(tài)存儲現(xiàn)在可以通過一個以上的過程衰變,，從而縮短熒光壽命,。這種壽命的改變可用于收集分子環(huán)境的信息。
一種特殊類型的淬滅是將激發(fā)能量以非輻射的方式傳遞到相鄰的不同熒光染料中：“熒光共振能量轉(zhuǎn)移"[2],，FRET,。此時，不僅第一個熒光染料（供體）變暗,，壽命變短,，而且第二個熒光染料（受體）在“錯誤的"激發(fā)顏色下開始發(fā)光,。由于這種效果的產(chǎn)生需要兩種熒光染料（小于10 nm）的密切接觸,，因此將其用作研究分子相互作用的“分子標尺"。它也是許多現(xiàn)代FRET生物傳感器的基礎(chǔ),，專門用于測量活體樣本中的各種細胞內(nèi)參數(shù)：Ca2+或其他離子濃度追蹤,、酸堿度、極性和電位測量,、蛋白質(zhì)相互作用等,。
FLIM的黃金標準是“時間相關(guān)單光子計數(shù)"[3]TCSPC，它與多光子共聚焦顯微鏡兼容,。用光脈沖照射樣本,，測量發(fā)射光子到達的時間。為重建典型的壽命,，這種測量要在同一樣本位置重復(fù)幾次,。需要測量幾百個事件才能達到大約10%的準確度。然后將數(shù)據(jù)按時間分組放入直方圖中,。然后對該直方圖中隨時間出現(xiàn)的衰變進行數(shù)學(xué)擬合,，并直接提供所需的熒光壽命（圖01a-c）。
圖01a：測量激光脈沖激發(fā)（藍色箭頭）后發(fā)射光子（紅色箭頭）的到達時間t?,。此處繪制了5個測量值,。
圖01b：到達時間的直方圖，包括上述示例中五個事件的集合,。大多數(shù)計數(shù)#時間都很短,。直方圖用指數(shù)衰減（紅色）來擬合,。
圖01c：擬合顯示，例如,，兩個單衰變（藍色和綠色曲線）,，衰變時間t?和t?，振幅為A?和A?,。求和將再次獲得紅色衰變曲線,。
這個過程是zuijing確的，并可以重復(fù),，但需要一定時間,。測量后，系統(tǒng)在大約100納秒的死區(qū)時間內(nèi)準備好進行下一次發(fā)射,。要錄入400個事件,，測量一個像素的時間達40微秒。一張512x512的圖像大約需要12秒,，這無法適應(yīng)快速變化和移動的生命系統(tǒng),。
目前的解決方案需要一定的技術(shù)靈活性、復(fù)雜的手動數(shù)據(jù)處理和jing密的評價程序,。
徠卡顯微系統(tǒng)推出了一款FLIM顯微鏡：FALCON（FAst Lifetime CONtrast）熒光壽命成像系統(tǒng)可以解決以上所有問題,。
本系統(tǒng)基于混合探測器（HyD）[4]，是理想的壽命成像傳感器,，具有極短的死區(qū)時間,。激光脈沖序列和發(fā)射光子脈沖都以高采樣率即刻實現(xiàn)數(shù)字化，將測得的距離直接輸入數(shù)據(jù)池,。這些到達時間用于輸出“快速-FLIM"圖像,。
新方法允許使用大多數(shù)激光脈沖，并應(yīng)用一個過濾器來限制只有一個光子發(fā)射的脈沖事件,。在第一個光子到達后不久,，隨即到達的光子不可避免的會被忽略，可以通過智能數(shù)學(xué)方法進行校正,?；谝陨戏N種因素，圖像記錄速度提高了10倍,。
所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦顯微鏡中,。記錄FLIM就像激活一個額外的通道。用于3D,、時間和光譜系列的多維采集模式可立即用于FLIM成像,。例如標題圖像：具有經(jīng)典組織學(xué)染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR軟件，創(chuàng)建了722個圖塊,，每個圖塊為512x512像素的圖稿,。原始圖像有1.9億像素。用四個指數(shù)對壽命進行擬合,，并以顏色進行編碼,。
在功能成像領(lǐng)域，我們希望監(jiān)測小分子,、離子或電勢的動態(tài)變化,。這通常是用熒光探針完成的。其中多數(shù)顯示出強度和壽命的變化,。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質(zhì),，并在活細胞中表達這些構(gòu)建體。該技術(shù)利用FRET跟蹤活細胞中的分子相互作用,。最為現(xiàn)代化的工具是蛋白質(zhì)或肽,，它們與所需的分析物（例如Ca2+）結(jié)合，并裝飾有一對進行FRET的熒光蛋白,。結(jié)合分析物后,，肽將發(fā)生構(gòu)象變化，F(xiàn)RET將出現(xiàn)或消失,。這些探針被稱為FRET-生物傳感器,。生物傳感器的一種是利用cAMP結(jié)合蛋白Epac[5]。
圖02：用游離態(tài)的cAMP刺激培養(yǎng)細胞,，并用Epac FRET-生物傳感器進行監(jiān)測,。在紅色圓圈區(qū)域分析信號（平均到達時間t?）,。隨時間變化的圖示見底部,。由K.Jalink，B.van den Broek,，NKI Amsterdam(NL)提供,。
FALCON的技術(shù)速度夠快，可以在活細胞中使用化學(xué)傳感器和FRET生物傳感器進行熒光壽命成像,。
無染色應(yīng)用是分析活體材料中的內(nèi)源性熒光,。例如：癌細胞抑制細胞呼吸，傾向于無氧糖酵解（瓦博格效應(yīng)）,，這會導(dǎo)致積累更高濃度的熒光NADH[6],。即使沒有活檢，多光子顯微鏡也能在皮膚組織中進行深度成像,。同樣,，壽命對比度要可靠得多，因為深層的顯微鏡會受到吸收和陰影效應(yīng)的影響,，從而使強度信號失真,。
傳統(tǒng)意義上,，不同的熒光染料以其不同的顏色來區(qū)分。如果激發(fā)和發(fā)射相同,，仍然可以通過壽命進行區(qū)分,。發(fā)射強度和壽命可以作為顏色的函數(shù)獨立記錄。因此,，可見熒光染料的數(shù)量是發(fā)射光譜和擬合壽命的乘積,。
圖03：lt-染料分離的原理證據(jù)（6個信號）。用480 nm激發(fā)云杉葉的新鮮切片,，在兩個通道（頂部和底部行）中進行記錄,，每個通道可分開顯示三個壽命（從左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持,。
徠卡顯微系統(tǒng)的FALCON（FAst Lifetime CONtrast）共聚焦和多光子顯微鏡匯集了所有這些新技術(shù)和新概念,，生成FLIM技術(shù)，適用于多個應(yīng)用領(lǐng)域,。相較于傳統(tǒng)的TSCPS方法（時間相關(guān)單光子計數(shù)）,，圖像采集速度快了10倍，是迄今為止壽命成像的黃金標準,。從而可以使用壽命對比來監(jiān)測活體樣本的運動學(xué)和動力學(xué)情況,。
其直接實現(xiàn)和自動化使研究人員不再需要耗時于硬件調(diào)整和數(shù)據(jù)評估。3D堆疊,、延時序列,、鑲嵌掃描和激發(fā)或發(fā)射波長掃描等復(fù)雜的數(shù)據(jù)采集模式與FLIM技術(shù)無縫結(jié)合。
相關(guān)產(chǎn)品
STELLARIS 8 FALCON FLIM熒光壽命成像顯微鏡
參考文獻：
1.Gerritsen et al: Fluorescence Lifetime Imaging in Scanning Microscopy. Pawley J (Ed) Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed. Springer New York (2006)
2.F?rster T: Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physik. 437, p 55 (1948)
3.Becker W: Fluorescence lifetime imaging – techniques and applications. J. Microscopy 247/2, pp 119-136 (2012)
4.Borlinghaus RT, Birk H & Schreiber F: Detectors for Sensitive Detection: HyD. In: Mendez-Vilas A (ed.): Current microscopy contributions to advances in science and technology, Formatex Vol. 5, 818-825 (2012)
5.Ponsioen B et al: Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO reports 5/12 pp 1176-1180 (2004)
6.Georgakoudi I et al: NAD(P)H and Collagen as in Vivo Quantitative Fluorescent Biomarkers of Epithelial Precancerous Changes. Cancer Research 62, 682– 687 (2002)
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