從濾光片轉(zhuǎn)輪到聲光可調(diào)濾光器（AOTF）
熒光的激發(fā)需要特定顏色的光：既要有效地激發(fā)探針（波長接近探針激發(fā)光譜的最大值）,，又要留下足夠的空間收集發(fā)射光而不會進(jìn)入檢測器的光路中。在共聚焦顯微鏡中,，通常使用多譜線激光器或激光電池作為激發(fā)光源,，這需要設(shè)備既能夠自由選擇適合當(dāng)前實(shí)驗(yàn)所用熒光團(tuán)的激發(fā)譜線又能夠控制該激發(fā)譜線的強(qiáng)度因?yàn)橹苯釉诠庠刺幙刂茝?qiáng)度時，大多數(shù)激光器會出現(xiàn)噪音增強(qiáng)的現(xiàn)象,。AOTF（聲光可調(diào)濾光器）的引入簡化了濾光過程,，同時顯著提高了實(shí)驗(yàn)的靈活性。AOTF對于耦合白激光源是明智選擇。
濾光片轉(zhuǎn)輪-早期的濾光工具
共聚焦顯微鏡中熒光的激發(fā)光源是激光或不同顏色的激光組合,。出于技術(shù)原因共聚焦選擇激光作為光源[2],。但是傳統(tǒng)激光器通常只發(fā)射一條或幾條單一波長的激光譜線（現(xiàn)代化解決方案是白光激光器[3]）。然而,，生物醫(yī)學(xué)成像所使用的熒光染料的激發(fā)光譜從近紫外到近紅外的都有,。大多數(shù)情況下，為了同時檢測幾種不同熒光染料的發(fā)射情況,，需要通過二向色鏡結(jié)合一系列激光譜線來實(shí)現(xiàn),。在這種情況下，與在熒光照明中分離激發(fā)和發(fā)射光的“分光鏡"相比,，反射鏡以反向模式使用,。
由于通常激光器的低頻噪聲頻帶相對較窄，因此不建議直接通過激光功率控制強(qiáng)度,。因此,，需要一種設(shè)備來單獨(dú)減弱激光強(qiáng)度。同樣,，如果關(guān)閉和打開光源次數(shù)過多,，激光器壽命也會縮短。特別是氣體激光器,，在關(guān)閉后仍處于高溫狀態(tài)而未冷卻時,，不適合馬上再次開啟。
“激光電池"滿足以上所有要求,，它由一系列激光器（通常為3-5個）組成,。所有激光器均配有光閘，光閘由機(jī)電驅(qū)動并由軟件控制,。所有激光器都需要一個用于減弱強(qiáng)度的伺服控制設(shè)備（一個帶有一系列灰度濾片濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊）多譜線激光器還需要另一個濾光片轉(zhuǎn)輪或滑塊,，它包含一系列邊緣濾片和帶通濾片，以便選擇單譜線或組合譜線,。
顯然,，整個設(shè)置可能會變得略微復(fù)雜低效，容易出現(xiàn)錯位和漂移問題,，可能在濾片選擇切換過程中引發(fā)機(jī)械振動,。若改變激發(fā)方案，成像的效率將非常低下,，由于安裝在濾光輪或滑塊上的濾光片數(shù)量有限,，該設(shè)備靈活度不高。
圖1：傳統(tǒng)的“激光電池"帶有5個激光管,、5個機(jī)械光閘,、8個光束組合鏡、5個衰減濾光片轉(zhuǎn)輪和1個用于多參數(shù)共聚焦顯微鏡的選擇激發(fā)譜線濾光片轉(zhuǎn)輪。
聲光可調(diào)濾光器-運(yùn)行方式
簡化機(jī)械設(shè)置并將靈活性提高幾個數(shù)量級的一個重要步驟是采用聲光可調(diào)濾光器（AOTF）,。AOTF是一種可以控制所需顏色的光指向一個不同的方向的設(shè)備,，而其余顏色的光直接通過 AOTF [1]。AOTF由晶體制成,，通常是TeO2或SiO2或其他具有類似特性的化合物,。晶體由機(jī)械轉(zhuǎn)換器在幾百兆赫范圍內(nèi)的機(jī)械波激發(fā)（聲光可調(diào)濾光器的“聲"是指機(jī)械波，盡管頻率不符合人耳可聽見聲音的頻率）,。最重要的是所需光束偏轉(zhuǎn)的方向是固定的,，不會隨光的顏色而改變,。此外,，方向的進(jìn)光量也可以通過機(jī)械波的振幅進(jìn)行控制。
激光電池發(fā)射出不同波長的激光譜線（準(zhǔn)直）后,，AOTF可以選擇任意波長的譜線使之偏轉(zhuǎn)至所需方向,，并可控制該譜線的能量。AOTF可以真正同時選擇多條譜線,，譜線數(shù)量主要取決于采購設(shè)備具體情況,。一個好的系統(tǒng)可同時提供8條譜線。
總而言之,，AOTF用機(jī)械固定的單晶*取代了上述所有快門,、衰減濾片和譜線選擇濾片，可以輕松實(shí)現(xiàn)任意譜線的組合,；當(dāng)激光電池同時提供8條譜線時,，組合方式達(dá)到256種——這對于AOTF來說不是問題。另外：每條選定的譜線在強(qiáng)度上都是無級可控的,。本質(zhì)上,，AOTF是一個“8-通道激光調(diào)光器"。
工程師可能會認(rèn)為,，AOTF將兩種偏振模式導(dǎo)向不同的方向,。這是*正確的，并不損害概念,。無論如何,，激光都是偏振光，因此光將始終指向既定方向,。垂直方向無激光,，沒有任何指向。
圖2：在以傳統(tǒng)激光電池為光源的共聚焦照明中,，AOTF（右邊的方框）替換了所有快門,、衰減濾片和譜線選擇濾片，任何進(jìn)入AOTF的譜線都可以得到抑制、衰減或*用于共聚焦顯微鏡,。由激光器發(fā)射的任意譜線都可進(jìn)行組合（組合數(shù)量大但有限）,。
AOTF-額外的好處
圖3：用不同激光譜線或不同強(qiáng)度的同一條激光譜線掃描感興趣的區(qū)域。在激光譜線掃描期間,，照明方式會根據(jù)預(yù)定義的模式在預(yù)設(shè)點(diǎn)發(fā)生變化,。任何組合都是可能的，幾乎所有圖形都可以使用鼠標(biāo)在預(yù)掃描的圖像上繪制,。當(dāng)然,，也可應(yīng)用幾何圖案（矩形、圓形,、橢圓形……）,。“零線"也是一種模式,，常用于保護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)物中的背景細(xì)胞,。
聲光分束器可在特定樣本中進(jìn)行任一符合熒光染料組成的激光組合。除此以外,，假設(shè)用兩種不同的熒光染料對標(biāo)本進(jìn)行染色,，一種非常強(qiáng)，另一種非常弱,，而無級調(diào)諧通過調(diào)暗明亮染料的激發(fā)來檢測強(qiáng)度相似的兩種熒光,，可以平衡熒光發(fā)射強(qiáng)度。因?yàn)锳OTF的控制速度很快,，不需要停止掃描過程,，所以很容易在成像過程中即時實(shí)現(xiàn)，
通過無級控制來平衡激發(fā)光強(qiáng)度,，不僅有利于對比熒光通道,，而且還是改善熒光染料光譜拆分的利器。許多染料的發(fā)射光譜出現(xiàn)“拖尾"現(xiàn)象,，導(dǎo)致在成像的通道收集了錯誤的信號,。通過將激發(fā)降低，可以改善發(fā)射光譜的拆分（抑制串色）,。
最后,，選定譜線的波長（和強(qiáng)度）之間的切換在幾微秒內(nèi)完成，速度非?？?；相比之下，機(jī)械標(biāo)準(zhǔn)濾光片轉(zhuǎn)輪大約需要一秒鐘,。這種快速切換使得在單條譜線的掃描期間可以改變激發(fā)方式（采用何種波長的譜線,，這些譜線分別對應(yīng)多大強(qiáng)度）,。此功能可在樣本上繪制用不同激發(fā)光激發(fā)的區(qū)域，即所謂的“感興趣區(qū)域",，在這些區(qū)域中,，不同的激光被激活用于成像。此外,，無需采集信號的區(qū)域不會被照射,，非常好地保護(hù)了樣本以供日后研究。本文開頭的圖片展示了這類感興趣區(qū)域,，在單次掃描中應(yīng)用了5種不同的參數(shù)設(shè)置,。
最后，如果選擇白光激光器作為光源,，AOTF可以選擇白激光中任何可用的顏色,。在此情況下，聲光可調(diào)濾光器將白激光光源變成可調(diào)光源,。
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