在顯微鏡學(xué)中，‘分辨率’一詞用于闡述顯微鏡對(duì)細(xì)節(jié)進(jìn)行區(qū)分的能力,。換言之,，這是樣本內(nèi)兩個(gè)能被觀察人員或者顯微鏡攝像頭區(qū)分的實(shí)體點(diǎn)之間的理想的距離。
顯微鏡的分辨率本質(zhì)上與光學(xué)元件的數(shù)值孔徑（NA）以及用于觀察樣本標(biāo)本的光波長(zhǎng)有關(guān),。此外,，我們必須考慮Ernst Abbe于1873年提出的衍射極限。
本文章包含了這些概念的歷史介紹并使用相對(duì)簡(jiǎn)單的術(shù)語(yǔ)對(duì)其進(jìn)行了解釋,。
分辨率與數(shù)值孔徑
數(shù)值孔徑（NA）與光通過(guò)的介質(zhì)的折射率（n）以及給定物鏡的孔徑角（α）有關(guān)（NA=n × sin α）,。顯微鏡的分辨率不僅取決于物鏡的NA，還取決于整個(gè)系統(tǒng)的NA,，要把顯微鏡聚光鏡的NA也納入考慮,。在顯微鏡系統(tǒng)中，所有光學(xué)元件都正確對(duì)齊,、具有相對(duì)較高的NA值并且相互協(xié)調(diào)工作,，可以分辨出更多的圖像細(xì)節(jié),。分辨率還與標(biāo)本成像所用的光波長(zhǎng)有關(guān)；波長(zhǎng)越短,，可分辨的細(xì)節(jié)越多,，波長(zhǎng)越長(zhǎng)則分辨細(xì)節(jié)越少。
在處理分辨率時(shí)需要考慮三個(gè)數(shù)學(xué)概念：‘阿貝衍射極限’,、‘艾里斑’和‘瑞利判據(jù)’,。以下按時(shí)間順序逐一介紹。
George Biddell Airy與‘艾里斑’（1835）
George Biddell Airy（1801-1892）是英國(guó)數(shù)學(xué)家和天文學(xué)家,。1826年,，25歲的他被任命為三一學(xué)院的數(shù)學(xué)教授，兩年后,，被任命為新劍橋天文臺(tái)的天文學(xué)教授,。1835年到1881年期間，他是“天文學(xué)家",，月球和火星上各有一處以他的名字命名的隕石坑,。
1835年，他在劍橋哲學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)報(bào)上發(fā)表了一篇題為《有關(guān)圓孔徑物鏡的衍射》的論文,。Airy在論文中以一個(gè)天文學(xué)家的視角描述了通過(guò)一個(gè)精良的望遠(yuǎn)鏡觀察到的恒星周圍的光環(huán)或者射線的形狀及亮度,。盡管是從不同的科學(xué)領(lǐng)域發(fā)表的文章，但這些觀察結(jié)果與其他光學(xué)系統(tǒng),，特別是顯微鏡存在著關(guān)聯(lián),。
艾里斑(Airy Disc)是在衍射限制的系統(tǒng)中由圓形孔徑形成的聚焦的光點(diǎn)。如圖1所示,，其呈現(xiàn)為中央亮點(diǎn)和周圍是明暗相間的同心環(huán)（更準(zhǔn)確地說(shuō),，這是艾里圖案Airy pattern）。
衍射圖案由光的波長(zhǎng)和光所通過(guò)的孔徑大小決定,。艾里斑的中心點(diǎn)含有大約84%的光強(qiáng),，其余16%分布于環(huán)繞該點(diǎn)的衍射圖案中。當(dāng)然,，用顯微鏡進(jìn)行觀察時(shí)標(biāo)本上會(huì)有許多光點(diǎn),，因此基于大量的艾里圖案來(lái)考慮，而非如“艾里斑"描述的單個(gè)光點(diǎn)來(lái)考慮是更妥當(dāng)?shù)姆绞健?/p>
圖1右所示的艾里圖案三維表示又稱為‘點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)’,。
圖1：艾里圖案,，或稱艾里斑的典型現(xiàn)象，由其中心的理想的光點(diǎn)和環(huán)繞的衍射環(huán)組成,。
Ernst Abbe與‘Abbe衍射極限’（1873）
Ernst Karl Abbe（1840-1905）是一位德國(guó)數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家,。他與Carl Zeiss共同創(chuàng)立了“蔡司光學(xué)工作室"即現(xiàn)在的蔡司公司。除此之外,，他還在1884年聯(lián)合創(chuàng)辦了Schott Glassworks,。Abbe還是定義數(shù)值孔徑這一術(shù)語(yǔ)的一位學(xué)者,。1873年，Abbe發(fā)表了自己的理論和公式對(duì)顯微鏡的衍射極限進(jìn)行了解釋,。Abbe發(fā)現(xiàn),，標(biāo)本圖像由許多重疊的、多強(qiáng)度且存在衍射極限的點(diǎn)（或艾里斑）所組成,。
要提高分辨率（d=λ/2 NA）,，標(biāo)本必須使用波長(zhǎng)（λ）更短的光來(lái)進(jìn)行觀察，或者通過(guò)折射率相對(duì)高的成像介質(zhì)來(lái)進(jìn)行觀察,，又或者使用NA較高的光學(xué)組件來(lái)進(jìn)行觀察（或者將全部3種因素組合起來(lái)）,。
但即便將所有這些因素都考慮在內(nèi)，顯微鏡系統(tǒng)的極限依然受到限制,，因?yàn)橄到y(tǒng)復(fù)雜性,，波長(zhǎng)低于400 nm的光在玻璃中的傳播特征，以及整套顯微鏡需要達(dá)到較高的NA,。理想光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率限制在200 nm左右,，而軸向分辨率約為500 nm（有關(guān)分辨率極限示例，請(qǐng)參見(jiàn)下文）,。
John William Strutt與‘瑞利判據(jù)’（1896）
第三代瑞利男爵John William Strutt（1842-1919）是一名英國(guó)物理學(xué)家,，也是一位高產(chǎn)學(xué)者。他一生編寫了多達(dá)466篇論文,，包括430 篇科研論文,。他的論文涉獵極廣，各種主題都有,，如鳥(niǎo)類飛行,、心理研究、聲學(xué)等等,。1895年,，他發(fā)現(xiàn)了氬并憑借這一發(fā)現(xiàn)于1904年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。
Rayleigh以George Airy的理論為基礎(chǔ)上并進(jìn)一步延伸,，于1896年創(chuàng)造了“瑞利判據(jù)"理論(Rayleigh Criterion)。瑞利判據(jù)（圖2）在衍射極限系統(tǒng)當(dāng)中定義了分辨率極限,，換言之,，就是何時(shí)能夠?qū)?個(gè)光點(diǎn)相互區(qū)分或分辨。
使用艾里斑理論,，如果2個(gè)單獨(dú)艾里斑的衍射圖案不重疊,，則就可以輕松區(qū)分、‘分辨’兩者并認(rèn)定滿足瑞利判據(jù)（圖2,，左圖）,。而當(dāng)艾里斑的中心直接重疊于另一個(gè)艾里斑的第一理想的衍射圖案時(shí),，則兩者認(rèn)定為‘剛好分辨’，同時(shí)依然可以區(qū)分為2個(gè)獨(dú)立的光點(diǎn)（圖2,，中圖）,。如果艾里斑再繼續(xù)相互接近，則兩者無(wú)法滿足瑞利判據(jù),，因此“無(wú)法被分辨"為2個(gè)不同的光點(diǎn)（或者標(biāo)本圖像中的單獨(dú)細(xì)節(jié),；圖2，右圖）,。
圖2：分辨率極限（按瑞利判據(jù)來(lái)定義）,，兩個(gè)單獨(dú)艾里斑的重疊衍射圖案：左圖：分辨良好；中圖：剛好分辨,；右圖：未分辨
如何計(jì)算顯微鏡的分辨率
將以上全部理論都考慮在內(nèi)就可以明顯看出,，在計(jì)算分辨率的理論極*需要考慮很多因素。分辨率還取決于樣本性質(zhì),。我們來(lái)看一下使用阿貝衍射極限以及使用瑞利判據(jù)進(jìn)行的分辨率計(jì)算,。
首先應(yīng)當(dāng)要牢記：
NA= n x sin α
式中n為成像介質(zhì)的折射率，α是物鏡孔徑角的一半,。物鏡的理想的孔徑角大約為144o,。該角度一半的正弦為0.95。如果使用油浸物鏡且折射率為1.52,，則物鏡的理想的NA為1.45,。如果使用‘干式’（無(wú)浸沒(méi)）物鏡，則物鏡理想的NA為0.95（因?yàn)榭諝獾恼凵渎蕿?.0）,。
橫向（即XY）分辨率的阿貝衍射公式為：
d= λ/2 NA
式中λ 是標(biāo)本成像所用的光波長(zhǎng),。如果使用514 nm的綠光及NA為1.45的油浸物鏡，則分辨率的（理論）極限將達(dá)到177 nm,。
軸向（即Z）分辨率的阿貝衍射公式為：
d= 2 λ/NA2
同樣的,，如果我們假設(shè)通過(guò)波長(zhǎng)514 nm的光來(lái)觀察標(biāo)本且物鏡NA數(shù)值為1.45，則軸向分辨率為488 nm,。
在阿貝衍射極限的基礎(chǔ)上,，瑞利判據(jù)稍稍得到了細(xì)化：
R= 1.22 λ/NAobj+NAcond
式中λ為標(biāo)本成像用的光波長(zhǎng)。NAobj 為物鏡NA,。NAcond為聚光鏡NA,。‘1.22’是一個(gè)常系數(shù),。該數(shù)值根據(jù)Rayleigh的貝塞爾函數(shù)研究推導(dǎo)得出,。這些主要用于對(duì)系統(tǒng)當(dāng)中的問(wèn)題，例如波的傳遞,，進(jìn)行計(jì)算,。
將聚光鏡的NA考慮在內(nèi),，空氣（折射率為1.0）通常是聚光鏡和玻片之前的成像介質(zhì)。假設(shè)聚光鏡的孔徑角為144o,，則NAcond數(shù)值將等于0.95,。
如果使用514 nm的綠光，油浸物鏡的NA為1.45,，聚光鏡的NA為0.95,，則分辨率的（理論）極限將達(dá)到261 nm。
如上所述,，用于對(duì)標(biāo)本成像的光波長(zhǎng)越短,，可以分辨的細(xì)節(jié)越多。因此如果使用400 nm的理想的可見(jiàn)光波長(zhǎng),，油浸物鏡NA為1.45,，聚光鏡NA為0.95，則R等于203 nm,。
要在顯微鏡系統(tǒng)當(dāng)中達(dá)到（理論）分辨率的理想值,，每個(gè)光學(xué)組件都應(yīng)當(dāng)具備理想的可用的NA（把孔徑角納入考慮）。此外,，觀察標(biāo)本所用的光波長(zhǎng)越短則分辨率越高,。最后，整個(gè)顯微鏡系統(tǒng)都應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)直對(duì)齊,。
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