免疫熒光
IF是一種通過熒光基團標記檢測細胞內有機分子,,胞內定位及其相互作用關系的成像研究手段,。IF制劑可通過多種顯微鏡技術(如激光共聚焦、寬場熒光,、全內反射成像等)來加以分析,,具體取決于應用目的或研究人員的關注重點。與此同時,,在很多使用至少一套簡易熒光顯微鏡的研究工作組當中,,IF早已成為*的一部分。
IF實驗的核心部分是兩種不同組分的組合:
首先是特異性抗體,,用于形成免疫復合物來標記細胞內需要研究的分子,,大多數情況下為蛋白質。
其次是熒光色素,,與免疫復合物耦合,,可以利用顯微鏡進行觀察目標結構。
圖1:圖中顯示了間接免疫熒光的典型工作流程,,上皮細胞粘附在蓋玻片上生長,。培養(yǎng)后細胞被固定,因此用化學交聯(lián)劑(如甲醛)將其殺死,。再用清潔劑進行透化處理,,使抗體穿過細胞膜。用正常血清,、奶粉或牛血清白蛋白來進行封閉,,可減少抗體與非靶向結構的非特異性結合,從而減少假陽性信號,。接下來與一抗進行孵育,,特異性識別靶向分子上的表位。在第二個培育步驟中,,應用熒光耦合二抗,,與一抗結合來實現靶向結構的可視化觀察??贵w孵育后,,用DAPI或Hoechst等嵌入DNA的染料進行細胞核染色。在顯微鏡載玻片上涂有封固介質(例如Mowiol或Prolong Gold)的蓋玻片后,,IF即已準備好進行顯微鏡觀察,。
直接與間接免疫熒光
根據實驗類型的不同,有兩種不同的IF變體可以使用:第一種是直接IF或一級IF,,一種具有特異性的一抗,,能夠與熒光色素連接用于結合靶向結構并實現直接可視化觀察,。
第二種變體是指間接或二級IF,這種變體需要采用兩步式培育,。首先,,特異性一抗識別靶向結構。然后應用與一抗特異結合的熒光色素耦合二抗,。這種特異性是通過引導二抗抵御產生一抗的物種而獲得的(見‘抗體和熒光色素’章節(jié)),。比較兩種IF變體可見兩者各有不同的優(yōu)缺點:
通過耦合一抗和熒光色素,耗時的清洗和培育步驟被省略,,所以直接IF比間接IF更快,。因此,直接IF更易于處理,,適合于在標準IF實驗中(例如在臨床實踐中)對樣本進行快速分析,。但必須使用一種功能良好且對其抗原高度敏感的一抗。這同時也是一個缺點,,因為熒光耦合和驗證的一抗成本較為高昂,。此外,每個靶向結構都需要一個單獨的一抗,,與間接IF相比,,抗體與直接IF中的熒光色素的連接限制了設計實驗的靈活性。
這種靈活性是間接IF的顯著優(yōu)勢之一,。通常在IF反應過程中,,同一樣本都會有幾個不同的靶結構需要實現可視化觀察,因此必須為每個靶向分子選擇一個離散的熒光色素,。
在間接IF中,,不同的熒光耦合二抗可以與不同的一抗結合(當然還要考慮到物種的反應性)。相較之下,,如果想在直接IF中對靶向結構“玩"顏色組合,,則需要為每一種顏色使用單獨的一抗。間接熒光的另一個優(yōu)點是二抗的信號放大,。多個二抗分子可與一個一抗結合來實現熒光增強,,這意味可減少使用一抗。
間接IF的工作流程可能需要花費更多時間,,但由于一抗和二抗能夠組合而且整個操作過程的經濟性更高,,因此間接熒光成為了絕大多數研究人員的首要選擇方法。
圖2:有兩種方法通過免疫熒光顯示靶向結構:在兩種變體中,,一種特異的一抗用于識別靶分子上的特定表位,。在此圖中,目標分子由幾個相同的蛋白質亞單位(=大分子)組成,因此會在每個亞單位上表現出幾個相同類型的表位,。為方便簡化,,此處只描繪了一個表位。
直接IF中,,一抗直接連接到熒光色素,在顯微鏡下觀察靶向結構,。間接IF中,,熒光耦合二抗在第二培育步驟中使用,從而專門對一抗進行標記,。因為多個二抗分子可以結合到一個一抗上,,所以選擇抗體和熒光色素的靈活性更大,并能夠進一步放大信號,。
抗體與熒光色素
高質量的IF染色當中,,最重要的工具是良好的一抗。同時,,幾乎每種細胞類型中的每種蛋白質都有一種或幾種市售抗體,。但此處需要強調若干重要注意事項。
要根據IF染色來做出精確的科學或臨床聲明,,就必須確保一抗對其目標抗原的特異性,。在操作中,研究人員不應*依賴商業(yè)供應商的說明,。應根據之前的使用經驗以及文獻中確認有效的一抗來進行抗體選擇,。查看制造商網站上的抗體數據表,查看IF染色的可用圖片并與自身期望相比較,,或者與其他已發(fā)布的插圖進行比較,。注意抗體的克隆號,因為單克隆抗體只與一個表位特異性結合,,而多克隆抗體可識別多個表位,,因此有可能存在非靶向結構的非特異性標記。所以,,特異性較高且性能較優(yōu)的單克隆抗體通常更昂貴,,但也能獲得更好的效果。
如希望開展多色間接IF實驗,,則不同的一抗必須衍生自不同的物種,,以便在之后通過熒光耦合二抗來區(qū)分免疫復合體(見表1)。比如,,您希望使用小鼠衍生的抗體抗蛋白A,、兔衍生的抗體抗蛋白B和大鼠衍生的抗體抗蛋白C來實施IF檢查。在選擇二抗時必須記住,每種抗體都只能特定識別一種一抗,。此外,,在這三種二抗的例子中,熒光色素的波長光譜必須不同,,以便在顯微鏡分析中辨別熒光信號,。如今,可以買到與熒光色素相連的二抗,,其波長范圍從紫外線到紅外線,,幾乎可以針對任何物種的一抗。因此,,研究人員目前僅受到現有顯微鏡(濾光片組,、激發(fā)激光器)配置的限制。利用新型的激光器,,可以擴展紅外一區(qū)的信號(圖一,、二)。
靶向蛋白質 | 蛋白質 A | 蛋白質 B | 蛋白質 C |
靶向物種 | 人類 | 人類 | 人類 |
一抗 | 抗蛋白 A | 抗蛋白 B | 抗蛋白 C |
一抗物種 反應性 | 小鼠抗人 | 兔抗人 | 大鼠抗人 |
二抗物種 反應性 | 羊抗小鼠 | 羊抗兔 | 羊抗大鼠 |
熒光色素 激發(fā)/發(fā)射 | 490/525 nm | 556/573 nm | 650/665 nm |
表1:此處的多色間接IF示例演示了如何在同一個細胞中同時標記三種不同的蛋白質,。三種蛋白質的一抗必須來自不同的物種,,以便用三種不同的熒光色素耦合二抗來進行檢測。二抗的熒光色素必須在波長光譜上有所區(qū)分才能在顯微鏡下進行不同的分析,。
圖一 常見熒光蛋白和熒光素的發(fā)射光譜
圖二 在近紅外一區(qū),,利用新型熒光標記可以獲得更多信號。Cos-7細胞圖像,,使用SiR-Actin(657 – 740nm探測范圍),、AF750-Tom20(760 – 790nm)、AF790-Tubulin(810 – 850nm)標記,。樣本由蘇黎世大學的Jana D?hner和Urs Ziegler提供,。左:使用傳統(tǒng)的GaAsP探測器。右:使用STELLARIS 8,。
了解了借助免疫熒光方法觀察細胞的原理,,接下來獲得目標樣本并根據實驗設計合理制備用于熒光觀察的樣片。下一期將為您介紹如何為免疫熒光顯微鏡制備樣本,。
今年,,徠卡突破傳統(tǒng)免疫熒光多標數量的限制,開發(fā)了Cell DIVE超多標組織成像分析技術,。通過循環(huán)染色的方法,,可以實現一張組織切片,超過60個靶向蛋白的標記,。從單張切片中,,獲得更多的信息,。
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