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中級會(huì)員 | 第5年

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細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)的提取之PCP法、高壓超聲處理法及DMSO法的介紹

時(shí)間:2022/9/9閱讀:1715
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一,、苯酚╱氯仿╱石油醚法PCP


LPS分子鑲嵌于胞壁的外膜中,,用某些化學(xué)試劑將胞壁裂解(如酚)后LPS分子從破潰的胞壁中游離出來,。由于LPS是一種兩性分子,,故它們在不同溶劑中的溶解度,,*取決于該分子上的親水/疏水性基團(tuán)多少。S-LPS有完整的親水性О特異性側(cè)鏈,,所以SLPS屬親水性分子,。而RLPS,缺乏O特異性側(cè)鏈,,含有完整或不完整的核心多糖和完整的類脂A,,親水度不大,而易溶于有機(jī)溶劑中,,故而R-LPS用酚水法提取時(shí)所得的產(chǎn)量極低,。


PCP法是以90%苯酚、氯仿及石油醚406025:8所組成的單相混合提取液,,這一提取方法只能將LPS及與之緊密結(jié)合的透道蛋白Porin提取出來,,而其它成分則排除在提取液外。PCP法的水沉淀步驟僅能使LPS發(fā)生沉淀,,而透道蛋白仍溶于苯酚中,,故而PCP法所提取的LPS是一種較為純化的制劑。


PCP法對制取R型細(xì)胞的LPS產(chǎn)量十分滿意,,且無核酸污染,,蛋白質(zhì)含量也僅在0.11 %間,該法溫和,,在室溫520℃即可完成,,制取周期較短,適用于從RaRe的細(xì)菌,,可成功地提取R-LPS,,產(chǎn)量也相當(dāng)高。故PCP法是研究R-LPS的有用方法,。應(yīng)必須注意的是在PCP法中,,每一步操作均不應(yīng)使用鹽類,如MgCl2,、CaCl2,,否則會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量。



二,、高壓超聲處理法


以某些物理方法(如超聲波處理菌體細(xì)胞,,使其*破裂可增加繼后提取方法的*性,,從而可使LPS的產(chǎn)率增加,。Richard1983研制了一種既可提取光滑型又可提取粗糙LPS的新方法。該方法采用了高壓處理15000Ib/in2細(xì)菌的方法,,粉碎菌細(xì)胞,,繼又用超聲波處理,,促進(jìn)碎片*裂解,再以DNa s e,,RNa s e處理,消化核酸,。再加入蛋白酶去消化蛋白質(zhì),,離心12000xg,濃縮干燥,。如此制得的LPS,,產(chǎn)量為菌體的5181%(按測脂肪酸、糖和KDO),,蛋白質(zhì)為0.1%,、核酸1 %25%,,純度較高,,產(chǎn)量比酚水法高7倍,比PCP法高2倍,。


所得LPS經(jīng)各種免疫化學(xué)分析,,均提示用此方法提取的LPS其抗原結(jié)構(gòu)完整。其不足之處是堿性條件上的加熱,,以前認(rèn)為這一處理在于除掉蛋白質(zhì),,特別是對于有些細(xì)菌如綠膿桿菌有用,但對別的細(xì)菌恐屬多余,。應(yīng)當(dāng)指出的一點(diǎn)是,,堿性加熱條件使類脂體A上的脂肪酸酯降解。另外個(gè)不足之處是,,此方法較為復(fù)雜,,不易被一般實(shí)驗(yàn)室采用。


三,、DMSO


Adams介紹了一種較為簡單的LPS提取方法,。該法應(yīng)用二甲亞Dimethyl SulfoxideDMSO作為主要提取試劑,。以胞壁原料提制LPS,。主要步驟為將預(yù)先制取的干燥胞壁以60DMSO提取水洗,酸化丙酮處理,,冷凍干燥,。DMSO法提取的LPS產(chǎn)量是酚水法的10倍,但蛋白質(zhì)含量很高45%) ,。


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