一、鱟試劑的標(biāo)化問(wèn)題

鱟試劑為鱟變形細(xì)胞的細(xì)胞溶解物,，制備時(shí)可采用裂解法和機(jī)械方法使細(xì)胞破裂,。鱟試劑的敏感性可受到動(dòng)物個(gè)體差異、季節(jié)差異及生產(chǎn)工藝過(guò)程中不穩(wěn)定因素的影響,。因此各批次間,，其敏感性差異很大。即使是同一批試劑，由于操作,、保存方法,、環(huán)境因素等影響，其敏感性亦不一樣,。鱟試劑在液態(tài)時(shí)極不穩(wěn)定,，往往很難保存。貯存于4 ℃冰箱,，其活性一般于4~5月開(kāi)始下降,，8個(gè)月左右*失活。冷凍保存的穩(wěn)定性稍高于液態(tài)保存,。`真空凍干粉劑保存為目前最-好的方法,，- 30℃保存其有效期可達(dá)2年。

改善生產(chǎn)工藝,，控制制劑中的參數(shù),，可使試劑的敏感性和穩(wěn)定性增高。國(guó)內(nèi)丁友玲等報(bào)道,，鱟試劑含水量控制在5%以下,，總蛋白量控制在5mg/ml以上，Ca⁺⁺,、Mg⁺⁺控制在0.01~0.1M,，可使鱟試驗(yàn)的穩(wěn)定性提高，重演性增強(qiáng),。

試驗(yàn)前,，應(yīng)以WHO標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素作標(biāo)定，如試劑敏感性為1ng/ml或小于1ng /ml,，則認(rèn)為是敏感的,，可以應(yīng)用。美國(guó)制備了參考鱟試劑,，各種鱟試劑在應(yīng)用前與其比較,，可獲得相對(duì)效力。

除應(yīng)解決好鱟試劑的標(biāo)化問(wèn)題外,，對(duì)鱟試劑的操作程序亦應(yīng)標(biāo)化,，因?yàn)椴僮魃衔⑿〉牟町惣纯墒乖噭┑拿舾行愿淖儭?/span>

二、內(nèi)毒素的標(biāo)化問(wèn)題

從各種細(xì)菌制備的內(nèi)毒素,，或以同一種細(xì)菌制備的內(nèi)毒素,，或內(nèi)毒素批次間、批次內(nèi),，其活性均可不一致,。所以應(yīng)用LT法（鱟試驗(yàn)法,，Limulus test）檢測(cè)內(nèi)毒素時(shí)，需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)毒素作為對(duì)照參比,。

大腸桿菌內(nèi)毒素在各種細(xì)菌內(nèi)毒素的LT反應(yīng)上處于中值的位置（圖4）,，且其穩(wěn)定、可溶,，因此將大腸桿菌內(nèi)毒素作為參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素(Reference Standar d En-dotoxin,，RSE)是較為適宜的。

根據(jù)以上理由及原則,，美國(guó)FDA下屬的生物制品管理局(BOB)組織了大規(guī)模的研究,。制備了一系列標(biāo)準(zhǔn)參考內(nèi)毒素（表4）。分別命名為16,、EC,、EC-1，EC-2………,，EC-5,。其中EC-2是以大腸桿菌O₁₁₁B₄。(Braude株）提取的,，各項(xiàng)指標(biāo)均為滿(mǎn)意,。

日本從大腸桿菌UKTB中提取了內(nèi)毒素，作為日本的標(biāo)準(zhǔn)參考內(nèi)毒素,，采用酚水抽提法,，然后再用乙醇沉淀?；瘜W(xué)分析,、熱原性及鱟試劑激活性*符合RSE的標(biāo)準(zhǔn)。且其在干燥狀態(tài)下穩(wěn)定性極-好,，可長(zhǎng)期應(yīng)用,，但如溶于水，則穩(wěn)定性可下降,。

最近美國(guó)藥品部門(mén)已向WHO提供了一批新的RSE,，供國(guó)際上檢測(cè)時(shí)作為參比用,，這使LT試驗(yàn)結(jié)果容易統(tǒng)一,。實(shí)際上WHO對(duì)此早就組織了合作研究，包括多種鱟試劑及內(nèi)毒素,。

從理論上講,，一種RSE需滿(mǎn)足下述條件：①干燥制劑；②在性質(zhì)是可用的,；③在室溫下穩(wěn)定,；④吸濕性少；⑤易溶于水；⑥在水及生理鹽水中清澈,；⑦可致家兔及人反應(yīng),；⑧須從常見(jiàn)的菌株提取。

但目前所有RSE均不*符合上述條件,，因此,，有關(guān)內(nèi)毒素的標(biāo)化問(wèn)題仍須進(jìn)行深入的研究。

具體檢測(cè)時(shí),，各實(shí)驗(yàn)室可采用對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（Control Standard Endotoxin,，CSE)，但其效能必須先以RSE進(jìn)行標(biāo)定,。CSE效能的計(jì)算公式為:

CSE效能=GM比值×E  Eu/μg

其中GM比值為算術(shù)平均值,，E為RSE的效能，常為6000Eu/管,，CSE與 RSE作平行的LT試驗(yàn),，試管數(shù)N應(yīng)大于16，然后算出CSE與RSE相應(yīng)的比值R₁,，R₂,，……R_N，將這些比值換算成以10為底的對(duì)數(shù)值,，然后計(jì)算平均和標(biāo)準(zhǔn)的SD,，平均SD的反對(duì)數(shù)即為GM比值。

1981年9月美國(guó),、日本,、英國(guó)、西德,、瑞典,、意大利六國(guó)學(xué)者及監(jiān)定部門(mén)的代表在美國(guó)Woods Hole 海洋學(xué)院召開(kāi)了用于注射用品的鱟試劑和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的國(guó)際會(huì)議，會(huì)上Difco實(shí)驗(yàn)室的Fleishman報(bào)告了“自多種革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素的LT法檢測(cè)熱原的比較”一文,，提出了被檢內(nèi)毒素相對(duì)活力的概念,，即與參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（EC-2）比較后的相對(duì)活力，計(jì)算公式如下圖:

其中5 Eu/ng是FDA標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素EC-2的指-定活力,。